Методические рекомендации N МР 1.2.0300-22 "Выбор типа комбинированной токсичности наночастиц на основании экспериментальных исследований" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 26 сентября 2022 г.)

Методические рекомендации N МР 1.2.0300-22
"Выбор типа комбинированной токсичности наночастиц на основании экспериментальных исследований"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 26 сентября 2022 г.)

ББК 51.245.1

В92

ISBN 978-5-7508-2020-7

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют алгоритм проведения экспериментальных исследований и подходы к выбору типа комбинированной токсичности наночастиц (далее - НЧ).

1.2. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими, научно-исследовательскими и иными организациями, занимающимися вопросами оценки безопасности наноматериалов.

II. Общие положения

2.1. В связи с широким внедрением наноматериалов в различные сферы промышленности, науки и медицины повышается вероятность того, что человек оказывается под одновременным или чередующимся комбинированным воздействием данных материалов.

2.2. Наноразмерные частицы образовываются как побочный продукт той или иной технологии (например, при электросварке, в сталеварении, в медеплавильной промышленности, в производстве сплавов, при их лазерной обработке). Возникает комбинированная экспозиция организма человека к загрязняющим воздух аэрозолям конденсации с наноразмерной фракцией элементно-оксидных частиц. В связи с чем обуславливается необходимость прогнозирования характера комбинированного токсикологического воздействия НЧ на организм человека с помощью проведения экспериментальных исследований для обоснования выбора типа комбинированной токсичности.

III. Планирование эксперимента для выбора типа комбинированной токсичности наночастиц

3.1. Планирование токсикологического эксперимента.

3.1.1. Экспериментальные исследования по изучению комбинированной токсичности НЧ планируются в 3 этапа:

- эксперимент in vitro на клеточных культурах (1 этап);

- эксперимент in vivo при однократном интратрахеальном воздействии НЧ на крыс (2 этап);

- эксперимент in vivo при многократном внутрибрюшинном воздействии НЧ на крысах (3 этап).

3.1.2. Исследование 1 этапа является не обязательным, но при его наличии повышается надежность данных для выбора типа комбинированной токсичности НЧ.

3.1.3. Исследования 3 этапа необходимы лишь в тех случаях, когда на 2 этапе обнаруживается более аддитивный тип комбинированного действия.

3.2. Этап 1. Эксперимент in vitro на клеточных культурах.

3.2.1. Исследование проводится в эксперименте in vitro на клеточной культуре (например, культура фибробластоподобных клеток) и начинается с определения уровня пороговой дозы при изолированном действии НЧ, которая подбирается эмпирическим путем в предварительном эксперименте по любым из представленных стандартных цитотоксических тестах ¹:

------------------------------

¹_{МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов" (далее - МУ 1.2.2635-10); ГОСТ 32647 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности" (далее - ГОСТ 32647).}

------------------------------

- содержание АТФ в культуре по люминесцентному сигналу;

- дегидрогеназная активность в МТТ-тесте;

- измерение лактатдегидрогеназы.

3.2.2. Далее планируется основной эксперимент - оценка комбинированной цитотоксичности НЧ методами, указанными выше.

3.2.3. Для повышения устойчивости и достоверности математической модели рекомендуется использование не менее 2 доз каждого компонента. Оптимальная разница между дозами должна быть в половину меньше пороговой.

3.2.4. Если изучаемая комбинация содержит 2 компонента, то дизайн исследования составляется из следующих групп:

- контроль;

- b ₁ = x ₁;

- b ₁ = x ₂;

- b ₂ = x ₁;

- b ₂ = x ₂;

- b ₁ (x ₁) + b ₂ (x ₂);

- b ₁ (x ₂) + b ₂ (x ₂);

- b ₁ (x ₁) + b ₂ (x ₁);

- b ₁ (x ₂) + b ₂ (x ₁),

где: b ₁ - первый компонент, b ₂ - второй компонент, x ₁ - пороговая доза, x ₂ - от пороговой дозы.

3.2.5. Если изучаемая комбинация содержит 3 компонента, то дизайн исследования составляется из следующих групп:

- контроль;

- b ₁ = x ₁;

- b ₂ = x ₁;

- b ₃ = x ₁;

- b ₁ = x ₂;

- b ₂ = x ₂;

- b ₃ = x ₂;

- b ₁₂₃, каждого по x ₁;

- b ₁₂₃, каждого по x ₂,

где: b ₁ - первый компонент, b ₂ - второй компонент, b ₃ - третий компонент, x ₁ - пороговая доза, x ₂ - от пороговой дозы.

3.2.6. После проведения исследования, выбирается эффект (предпочтение отдается специфичным тестам), по которому будет производиться оценка комбинированного действия НЧ.

3.3. Этап 2. Эксперимент in vivo при однократном интратрахеальном воздействии НЧ на крысах.

3.3.1. Исследование проводится в эксперименте in vivo на белых беспородных крысах.

3.3.2. При подборе доз НЧ для проведения исследований in vivo по оценке комбинированной токсичности НЧ рекомендуется использовать имеющиеся литературные данные о токсичности изучаемых НЧ, обращая внимание на характер зависимости "доза - эффект" при их изолированном действии, а также учитывать данные о типах и механизмах комбинированного действия ранее изученных их аналогов, но в ионной форме или частиц в микрометровом диапазоне.

3.3.3. Если таких данных нет, то необходимо провести предварительное исследование при однократном интратрахеальном изолированном введении НЧ, доза которых подбирается эмпирически. Рекомендуется выбирать дозу НЧ, при которой не образовываются агломераты частиц.

3.3.4. Для приготовления суспензий НЧ в качестве основы используется деионизированная вода. Если используется среда, контрольная группа получает ее в максимальном объеме от используемого в экспериментальных группах ². Группе контрольных животных вводится деионизированная вода объемом, идентичным опытных групп ³.

------------------------------

²_{МР N 01-19/24-17 "Методические рекомендации по использованию клеточных систем "ин витро" и "ин виво" для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей" (далее - МР N 01-19/24-17).}

³_{Р 1.2.3156-13 "Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека".}

------------------------------

3.3.5. Группы лабораторных животных формируются рандомизированной выборкой из общего стада и содержатся в одинаковых контролируемых условиях, а исследования на них проводятся параллельно.

3.3.6. Вид, пол, вес, возраст и количество животных (не менее 8) в группах рекомендуются одинаковыми. Разброс по исходной массе тела животных в группе не рекомендуется превышать 10 %.

3.3.7. Состояние организма крыс оценивается по сдвигам бронхоальвеолярного лаважа (далее - БАЛЖ) в соответствии с методическими документами ⁴.

------------------------------

⁴_{МР N 01-19/24-17.}

------------------------------

3.3.8. Для проведения основного исследования дизайн эксперимента идентичен этапу 1.

3.4. Этап 3. Эксперимент in vivo при многократном внутрибрюшинном воздействии НЧ на крыс.

3.4.1. Исследование проводится при повторных внутрибрюшинных инъекциях НЧ крысам на протяжении 5 - 7 недель по 3 раза в неделю, для создания модели субхронической интоксикации. Отклонения от продолжительности воздействия обосновываются, особенно в случае сокращения сроков ⁵.

------------------------------

⁵_{МУ N 1.2.3699-21 "Подходы к экспериментально-токсикологическому обоснованию предельно допустимых концентраций наночастиц в воздухе рабочей зоны"; МР N 4050-85 "Постановка экспериментальных исследований по изучению характера комбинированного действия химических веществ с целью разработки профилактических мероприятий"; ГОСТ 32647.}

------------------------------

3.4.2. Выбор доз НЧ и формирование групп животных осуществляется аналогично этапу 2.

3.4.3. Эксперимент проводится в соответствии с методическими документами ⁶.

------------------------------

⁶_{МУ 1.2.2635-10; МР N 01-19/24-17.}

------------------------------

3.4.4. Для проведения основного исследования дизайн эксперимента идентичен этапу 1. Для минимизации возможности прямого химического взаимодействия между вводимыми веществами рекомендуется наполнять ими разные шприцы и устанавливать небольшой временной интервал между инъекциями для избежания агломерации НЧ.

IV. Математическое моделирование комбинированной токсичности наночастиц по экспериментальным данным

4.1. Для математического описания комбинированной токсичности НЧ используется методология построения поверхности отклика, обобщающая методы: дисперсионного анализа и математической теории организации эксперимента с помощью математических пакетов общего назначения. Согласно данной методологии, уравнение (1), описывающее поверхность отклика Y = Y (х ₁, х ₂, х ₃), строится подбором коэффициентов к данным эксперимента:

(1)

где: Y - количественный эффект токсической экспозиции; х ₁, х ₂, х ₃ - дозы или концентрации веществ, входящих в комбинацию.

Все члены в уравнении, содержащие третий компонент, исключаются анализом бинарной комбинации НЧ.

4.2. В случае определения типа комбинированного действия трехкомпонентной смеси НЧ трехфакторная модель (1) разделяется на три двухфакторные. Для этого в уравнение (1) для одного из токсикантов подставляется х = 0 (получаем первую модель) или х = 0,5 (получаем вторую модель); в качестве такого токсикантах по очереди выступают х ₁, х ₂ или х ₃ в двухфакторных моделях.

4.3. Двумя агентами вызывается однонаправленный эффект, если обе функции ответа Y (х ₁, 0) и Y (0, х ₂) одновременно увеличиваются или уменьшаются при увеличении значения х ₁ или х ₂. Если при увеличении значения х ₁ или х ₂ одна функция увеличивается, а другая уменьшается - действие принимается противонаправленным. Математической моделью, представленной уравнением (1), позволяет предсказать величину отклика Y для любой комбинации доз в пределах экспериментального диапазона фактических доз каждого фактора (рис. 1). Согласно данному графику, по осям абсцисс и ординат откладываются дозы.

а	б

Рис. 1. Сечение поверхности отклика Y = Y (х ₁, х ₂) в объеме (а) и его проекция на плоскость (б), представляющая собой изоболу Лёве

4.4. При сечении поверхности отклика на разных уровнях, соответствующих разным значениям эффекта Y или доз х, получается семейство изобол Лёве, у которых имеется одинаковая или разная форма, а также одинаковый либо противоположный наклон. Полученные семейства используются для наглядной интерпретации типов бинарного комбинированного действия НЧ (рис. 2): явный и скрытый антагонизм (противонаправленное и однонаправленное менее, чем аддитивное действие), аддитивность, синергизм (потенциирование).

а	б
в	г

Рис. 2. Изолоболограммы, иллюстрирующие типы комбинированного действия:
явный (а) и скрытый (б) антагонизм, аддитивность (в), синергизм (г); по осям абсцисс и ординат отложены дозы НЧ веществ А и В, линии изоболограмм показывают количественный эффект токсической экспозиции

V. Подходы к анализу данных и выбору типа комбинированной токсичности наночастиц

5.1. На основе вычисления уравнения (1) в пункте 4.1. и проведенного сечения поверхности отклика дается оценка комбинированного токсического действия НЧ: антагонизм, аддитивность и синергизм (рис. 2).

5.2. В экспериментах in vitro и in vivo типы комбинированной токсичности разнообразны и зависят от рассматриваемого эффекта, от уровня доз и их соотношения.

5.3. Итоговая токсикологическая оценка каждой изученной комбинации НЧ должна быть однозначной. Для выбора основного из всех вариантов комбинированной токсичности рекомендуется использовать ряд гигиенических критериев:

- превалирует тот тип комбинированной токсичности, который характерен для низких доз изучаемых НЧ;

- тип комбинированной токсичности устанавливается по функциональным показателям органов-мишеней и систем организма, играющих наибольшую роль в развитии интоксикации для изучаемой комбинации НЧ;

- если одно из веществ, входящих в изучаемую комбинацию НЧ, обладает генотоксичностью, канцерогенностью, репродуктивной токсичностью, то тип комбинированной токсичности устанавливается по показателям этих эффектов.

5.4. Представленный подход для двух или трехкомпонентной смеси НЧ позволяет определить более точную итоговую токсикологическую характеристику комбинированного действия изучаемых НЧ.

5.5. Токсичность многофакторных смесей (4 и более компонента) оценивается по эффектам действия на организм как единое вещество.

VI. Данные и отчетность

6.1. В протокол об исследовании рекомендуется включать описание исследуемого наноматериала, дизайн исследования, результаты в виде таблиц и рисунков, анализ результатов и заключение.

Рекомендуемая форма и примеры заполнения протоколов представлены в приложениях 1 и 2 к настоящим МР.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Р 1.2.3156-13 "Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека".

3. МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов".

4. МУ 1.2.3699-21 "Подходы к экспериментально-токсикологическому обоснованию предельно допустимых концентраций наночастиц в воздухе рабочей зоны".

5. МР 4050-85 "Постановка экспериментальных исследований по изучению характера комбинированного действия химических веществ с целью разработки профилактических мероприятий".

6. МР N 01-19/24-17 "Методические рекомендации по использованию клеточных систем "ин витро" и "ин виво" для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей".

7. ГОСТ 32647 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности".