Методические указания МУК 4.1.3816-22 "Определение остаточных количеств фомесафена в картофеле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 12 декабря 2022 г.)

Методические указания МУК 4.1.3816-22
"Определение остаточных количеств фомесафена в картофеле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 12 декабря 2022 г.)

ББК 51.23

О-62

ISBN 978-5-7508-2069-6

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения массовой концентрации фомесафена в картофеле в диапазоне 0,01 - 0,20 мг/кг без учета разбавления, 0,01 - 10,00 мг/кг с учетом разбавления в 50 раз.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного (пищевого) сырья и пищевой продукции, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного (пищевого) сырья, пищевой продукции.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Физико-химические и токсикологические свойства

2.1. Фомесафен - 5-(2-хлоро--трифлуоро-р-толилокси)-N-метил-сульфонил-2-нитробензамид ¹. Брутто-формула - C ₁₅H ₁₀ClF ₃N ₂O ₆S. Молекулярная масса 438,8.

------------------------------

¹_{В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).}

------------------------------

2.2. Белое порошкообразное вещество без запаха. Температура плавления плюс 219 °C. Давление паров 4·10 ^-3 мПа (при плюс 20 °C). Растворимость в органических растворителях при плюс 20 °C (в г/дм ³): ацетонитрил - 224; ацетон - 224; метанол - 233; н-октанол - 224; гептан - 1. Растворимость в воде при плюс 20 °C: 23 мг/дм ³. Коэффициент распределения в системе н-октанол/вода: Kow log Р = -1,2 (20 °C) при pH = 7.

2.3. Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD ₅₀) для крыс 1600 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ₅₀) для крыс и кроликов > 1000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC ₅₀) для крыс > 4,97 мг/дм ³ (4 часа).

III. Погрешность измерений

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций (согласно ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)).

Таблица 3.1

Метрологические характеристики

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (границы относительной погрешности, Р = 0,95), , %	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), r, %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), R, %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), %, (Р = 0,95)
картофель	0,01 - 10,00	50	4,5	6,3	13	18

Примечание. Диапазон определяемых концентраций, указанный в табл. 3.1, приведен с учетом разбавления образца в 50 раз.

IV. Метод измерений

4.1. Измерения концентраций фомесафена выполняют методом ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.

4.2. Экстракцию фомесафена из анализируемых проб клубней картофеля, выполняют смесью ацетонитрила и воды, подвергают центрифугированию, очистке экстракта на картридже, заполненным пористым сорбентом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола.

4.3. Нижний предел измерения фомесафена в анализируемом объеме проб - 2,5 нг. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.

Таблица 5.1

Средства измерений

Наименование средств измерения	Требования, нормативные документы
Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, термостатом колонки	Внесено в реестр "Утвержденные типы средств измерений" Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений
Прибор для измерения атмосферного давления, температуры и относительной влажности воздуха	Внесено в реестр "Утвержденные типы средств измерений" Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений
Весы лабораторные аналитические	Наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности 0,0005 г ГОСТ Р 53228
Весы лабораторные общего назначения	Наибольший предел взвешивания 420 г, предел допустимой погрешности 0,01 г ГОСТ Р 53228
Колбы мерные	Вместимостью 100, 500, 1000 см 3, ГОСТ 1770
Меры массы	ГОСТ OIML R 111-1
Пипетки градуированные	2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0 и 10 см 3ГОСТ 29227
Термометр лабораторный	Пределы измерения 35 - 55 °C, ТУ 25-2021.003
Цилиндр мерный	2-го класса точности вместимостью 100 см 3. ГОСТ 1770

Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Таблица 5.2

Реактивы

Наименование реактива	Обозначение и наименование документов, технические характеристики
Фомесафена	Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95 %
Ацетонитрил	Для ВЭЖХ, чистота не менее 99,9 %
Вода	Для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная), ГОСТ Р 52501
Калий углекислый (карбонат калия, поташ)	Химически чистый, прокаленный, ГОСТ 4221
Метиловый спирт (метанол)	Химически чистый, ГОСТ 6995
Уксусная кислота	Чистая для анализа, 99,5 %, ГОСТ 61
Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора)	Квалификация реактива: химически чистый
Кислота ортофосфорная	Химически чистая, 85 %, ГОСТ 6552

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Таблица 5.3

Вспомогательное оборудование, устройства, материалы

Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов	Обозначение и наименование документов, технические характеристики
1	2
Баня ультразвуковая	С рабочей частотой 35 кГц
Воронки химические	Конусные диаметром 40 - 45 мм по ГОСТ 25336
Груша резиновая	-
Измельчитель бытовой	-
Набор для фильтрации растворителей через мембрану	-
Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении	-
Холодильник/морозильник бытовой	-
Хроматографическая колонка	Стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами С-8 или С-18, зернением 5 мкм
Картридж для твердофазной экстракции	Содержащий пористый сорбент (60 мг) на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола, с размером частиц 30 - 60 мкм и размером пор 80 - 82 А
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работ с концентрирующим патронами-картриджами)	-
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар	-
Аппарат для встряхивания или орбитальный шейкер	Диапазон регулировки оборотов 50 - 200 об./мин, орбита до 10 мм
Виалы стеклянные	Объемом 2 см 3
Колбы круглодонные для упаривания, объемом 250 и 50 см 3	ГОСТ 25336
Колбы конические для экстракции, объемом 250 см 3	ГОСТ 25336
Насос водоструйный вакуумный	ГОСТ 25336
Бумажные фильтры	Средней и низкой плотности, обеззоленные (фильтры) по ГОСТ 12026
Мембраны микропористые капроновые на шприц	Размер пор 0,2 мкм
Колбы для упаривания	Объемом 250 см 3, 50 см 3, 100 см 3 или 150 см 3 по ГОСТ 25336
Делительная воронка	Объемом 250 мл по ГОСТ 25336

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

VI. Требования безопасности

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать технику безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостные хроматографы.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

VII. Условия измерений

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на приборы.

VIII. Подготовка к выполнению измерений

8.1. Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, смеси растворителей для растворения проб, подвижной фазы, установление градуировочных характеристик, отбор проб.

8.2. Очистка растворителей.

Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм ³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм ³ ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.

8.3. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

8.3.1. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,2 % (0,2 %-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1000 см ³ помещают 500 см ³ бидистиллированной или деионизованной воды, 2,0 см ³ ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки бидистиллированной или деионизованной водой и еще раз тщательно перемешивают.

8.3.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 см ³ помещают 600 см ³ ацетонитрила и 400 см ³ 0,2 %-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте стеклянной емкости не более 14 дней.

8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.3.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см ³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.5. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.5.1. Исходный раствор фомесафена для градуировки (концентрация 100 мкг/см ³). В мерную колбу вместимостью 100 см ³ помещают (0,0100 0,0005) г фомесафена, добавляют 50 - 70 см ³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в морозильной камере (при температуре не выше минус 18 °C) не более месяца.

Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

8.5.2. Раствор N 1 фомесафена для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см ³). В мерную колбу вместимостью 100 см ³ помещают 10 см ³ исходного раствора фомесафена с концентрацией 100 мкг/см ³ (п. 8.5.1), доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере (при температуре не выше минус 18 °C) не более месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено - найдено", а также контроле качества результатов методом "добавок".

8.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 фомесафена для градуировки (концентрация 0,05 - 1,0 мкг/см ³). В 5 мерных колб вместимостью 100 см ³ помещают по 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 см ³ градуировочного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/см ³ (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.3.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией фомесафена 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/см ³, соответственно.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "п. 7.5.2" следует читать "п. 8.5.2"

Растворы хранятся в холодильнике при температуре плюс (4 - 6) °C не более 7 дней.

8.6. Установление градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации фомесафена, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-м растворам для градуировки N 2 - 6.

В инжектор хроматографа вводят по 50 мм ³ каждого градуировочного раствора, приготовленного по п. 8.5.3 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площадь пика фомесафена.

8.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание фомесафена в которых входит в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,05 до 1,0 мкг/см ³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

, где

(1)

А - результат контрольной процедуры, %;

Х - концентрация фомесафена в пробе при контрольном измерении, мкг/см ³;

С - известная концентрация градуировочного раствора фомесафена, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см ³;

В - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (В = 10 % при Р = 0,95).

Если величина расхождения (А) превышает 10 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.

8.8. Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.

8.8.1. Смесь ацетонитрил: вода = 8:2. В мерную колбу на 500 см ³ вносят 400 см ³ ацетонитрила и 100 см ³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.8.2. Смесь ацетонитрил: вода = 2:8. В мерную колбу на 500 см ³ вносят 100 см ³ ацетонитрила и 400 см ³ бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

8.9. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования. Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см ³ метанолом, 1 см ³ ацетонитрилом, затем три раза по 1 см ³ смесью ацетонитрил: вода, в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.8.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования - 15 - 20 капель в минуту. Нельзя допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.

IX. Отбор и условия хранения проб

9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами ².

------------------------------

²_{Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79; ГОСТ 7176 "Картофель продовольственный. Технические условия"; ГОСТ 7194 "Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества".}

------------------------------

9.2. Пробы картофеля хранят при температуре плюс 2 - 6 °C не более недели.

Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.

X. Выполнение определения

10.1. Навеску измельченных клубней картофеля, массой 10 г, помещают в коническую колбу, объемом 250 см ³. Добавляют 50 см ³ смеси ацетонитрил: вода, в соотношении 8:2, приготовленной согласно п. 8.8.1. Перемешивают и помещают на встряхиватель на 30 минут. После чего, смеси дают отстояться. Раствор осторожно (для предотвращения взмучивания) фильтруется через неплотный бумажный фильтр. Осадок в колбе заливают 30 см ³ смесью ацетонитрил: вода (8:2), приготовленной согласно п. 8.8.1. Экстрагируют в течение 15 минут на встряхивателе. После отстаивания, раствор фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Фильтраты объединяют и переносят в круглодонную колбу, объемом 250 см ³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе, при температуре плюс 30 °C до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.9. картридж, со скоростью 15 - 20 капель в минуту. После пропускания пробы, картридж четыре раза по 1 см ³ промывают смесью ацетонитрил: вода в соотношением 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.8.2. Фомесафен элюируют с картриджа ацетонитрилом, 2 раза по 1 см ³. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см ³. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не плюс 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см ³ смеси ацетонитрил: вода, в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.8.1 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2.

10.2. Условия хроматографирования. Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;

- хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращено-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (С-18 или С-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;

- рабочая длина волны: 290 нм;

- температура колонки: плюс 50 °C;

- подвижная фаза: ацетонитрил - 0,2 %-я ортофосфорная кислота (60:40, по объему);

- скорость потока элюента: 0,8 см ³/мин;

- объем вводимой пробы: 50 мм ³;

- линейный диапазон детектирования: 2,5 - 50 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией вещества 1,0 мкг/см ³, разбавляют подвижной фазой (п. 8.3) (не более чем в 50 раз).

XI. Обработка результатов анализа

11.1. Содержание фомесафена в картофеле (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

, где

(2)

С - концентрация фомесафена, полученная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см ³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см ³;

К _р - кратность разбавления (если экстракт подвергался разбавлению);

m - масса анализируемого образца, г.

Примечание: идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, где

(3)

X ₁, X ₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом r=2,8· _r.

При невыполнении условия (3) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

XIII. Оформление результатов

13.1. Результат анализа представляют в виде:

, мг/кг, при вероятности Р = 0,95, где

(4)

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

, где

(5)

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание фомесафена в пробе картофеля - менее 0,01 мг/кг" ³.

------------------------------

³_{0,01 мг/кг - предел обнаружения фомесафена в картофеле.}

------------------------------

XIV. Контроль качества результатов измерений

14.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6). Периодичность и формы контроля определяется руководством по качеству.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

3. ГОСТ Р ИСО 5725 "Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

4. ГОСТ Р 53228 "Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания.

5. ГОСТ OIML R 111-1 "Государственная система обеспечения единства измерений".

6. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

7. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

8. ГОСТ 4221 "Реактивы. Калий углекислый. Технические условия".

9. ГОСТ 6995 "Реактивы. Метанол. Технические условия".

10. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

12. ГОСТ 20490 "Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия".

13. ГОСТ 6552 "Кислота ортофосфорная. Технические условия".

14. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

15. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

16. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

17. ГОСТ 12.0.004 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения".

18. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

19. ГОСТ 7176 "Межгосударственный стандарт. Картофель продовольственный. Технические условия".

20. ГОСТ 7194 "Государственный стандарт союза ССР. Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества".