Методические указания МУК 4.2.3886-23 "Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 июня 2023 г.)

3.3.2. Медицинские иммунобиологические препараты

Методические указания МУК 4.2.3886-23 ^*
"Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 28 июня 2023 г.)

------------------------------

^*_{МУК 4.2.3886-23 введены взамен МУК 4.2.1793-03 "Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами", утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 02.11.2003.}

------------------------------

I. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) определяют объемы лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами, за исключением возбудителя холеры.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. В соответствии с современными представлениями о таксономии вибрионов в состав семейства Vibrionaceae входит 3 рода: Vibrio, Photobacterium, Salinivibrio. Род Vibrio включает на сегодняшний день около 175 видов [10] (приложение 1 к настоящим МУК). Классификация вибрионов совершенствуется по мере накопления научных знаний.

2.2. Микроорганизмы рода Vibrio представляют прямые или изогнутые грамотрицательные палочки 0,5 - 0,8 мкм в диаметре и 1,4 - 2,6 мкм длиной, не образующие эндоспор и микроцист, в жидкой среде подвижны с помощью одного или многих полярно расположенных жгутиков, некоторые штаммы отдельных видов при росте на плотных средах способны образовывать латеральные жгутики. Растут в аэробных и анаэробных условиях. Вибрионы всех видов, за исключением V. metschnikovii, продуцируют оксидазу, ферментируют глюкозу, некоторые с выделением газа. Чувствительность к вибриостатику O/129 (2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридин) у разных видов варьирует. Ионы натрия стимулируют рост вибрионов.

Вибрионы повсеместно распространены и являются естественными обитателями пресных и соленых водоемов, а также гидробионтов, обитающих в них. Вибрионы многих видов являются галофильными. К негалофильным относят V. cholerae и V. mimicus. Для роста этих микроорганизмов достаточны следовые количества соли в среде.

Из всех известных видов вибрионов к патогенным для человека в настоящее время отнесены 12. Их основные признаки приведены в табл. 1.

Таблица 1

Дифференциация патогенных для человека видов рода Vibrio

Признаки и тесты	Наличие признака (%)
	V. cholerae	V. mimicus	V. metschnikovii	V. cincinnatiensis	V. hollisae (Grimontia hollisae)	V. damsela	V. fluvialis	V. furnissii	V. alginolyticus	V. parahaemolyticus	V. vulnificus	V. hareyi (carchariae)
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
Подвижность	99	98	74	86	0	25	70	89	99	99	99	0
Роение на агаре	-	-	-	+	-	-	-	-	+	+	-	+
Оксидаза	100	100	0	100	100	95	100	100	100	100	100	100
Образование: газа из глюкозы	0	0	0	0	0	10	0	100	0	0	0	0
индола	99	98	20	8	97	0	13	11	85	98	97	100
H 2S	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Ацетилметилкарбинола	75	9	96	0	0	95	0	0	95	0	0	50
Образование кислоты из: глюкозы	100	100	100	100	100	100	00	100	100	100	100	100
лактозы	7	21	50	0	0	0	3	0	0	1	85	0
мальтозы	99	99	100	100	0	100	100	100	100	99	100	100
арабинозы	0	1	0	100	97	0	93	100	1	80	0	0
маннозы	78	99	100	100	100	100	100	100	99	100	98	50
сахарозы	100	0	100	100	0	5	100	100	99	1	15	50
целлобиозы	8	0	9	100	0	0	30	11	3	5	99	50
маннита	99	99	96	100	0	0	97	100	100	100	45	50
салицина	1	0	9	100	0	0	0	0	4	1	95	0
Аргининдигидролаза	0	0	60	0	0	95	93	100	0	0	0	0
Лизиндекарбоксилаза	99	100	35	57	0	50	0	0	99	100	99	100
Орнитиндекарбоксилаза	99	99	50	0	0	0	0	0	50	95	55	0
Бета-галактозидаза	94	90	0	86	0	0	40	35	0	5	75	0
Нитратредуктаза	99	100	0	100	100	100	100	100	100	100	100	100
Рост в 1 % пептонной воде с: 0 % NaCl	100	100	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
3 % NaCl	100	100	100	100	99	100	99	99	99	100	99	100
6 % NaCl	53	49	78	100	83	95	96	100	100	99	65	100
8 % NaCl	1	0	44	62	0	0	71	78	94	80	0	0
10 % NaCl	0	0	4	0	0	0	4	0	69	2	0	0
Гидролиз мочевины	0	1	0	0	0	0	0	0	0	15	1	0
Тест тяжа	100	100	100	80	100	80	100	100	91	64	100	100
O/129, зона ингибирования	99	95	90	25	40	90	31	0	19	20	98	100
Примечание: "+" - большинство штаммов (90 - 100 %) по данному признаку позитивны; "-" - большинство штаммов негативны по данному признаку

2.3. Патогенные для человека вибрионы, кроме возбудителей холеры, могут быть причиной острых кишечных инфекций, не имеющих тенденции к эпидемическому распространению, или заболеваний с внекишечной локализацией возбудителя. Инфицирование людей связано с купанием в морской воде, употреблением в пищу продуктов моря, ловлей и разделкой рыбы, моллюсков. Заболевания, обусловленные патогенными вибрионами, регистрируют в основном в прибрежных районах в теплое время года, зачастую в момент массового отлова обитателей водоемов. Виды вибрионов, имеющие значение в патологии человека, и обусловливаемые ими синдромы заболеваний приведены в табл. 2.

К группе вибрионов, вызывающих преимущественно острые кишечные инфекции, относят V. cholerae non O1/non O139, V. parahaemolyticus, V. fluvialis, V. mimicus, V. hollisae (Grimontia hollisae) ¹. V. vulnificus, V. alginolyticus, V. damsela, V. cincinnatiensis, V. harveyi (V. carchariae) чаще обусловливают раневые инфекции и септицемии.

------------------------------

¹_{Код A 04.8, A 05.3, A 05.8 по Международной классификации болезней МКБ-10.}

------------------------------

Таблица 2

Виды патогенных вибрионов и связанные с ними заболевания

Виды вибрионов	Клинические проявления заболеваний
	Гастроэнтерит	Раневая инфекция	Инфекция уха	Септицемия
V. cholerae O1 и O139	+++	+	-	-
V. cholerae non O1/non O139	+++	++	+	++
V. mimicus	++	+	+	-
V. fluvialis	++	+	-	-
V. parahaemolyticus	+++	+	-	+
V. alginolyticus	(+)	++	++	+
V. cincinnatiensis	-	+	-	+
V. hollisae (Grimontia hollisae)	++	-	-	+
V. vulnificus	(+)	++	-	++
V. furnissii	(+)	-	-	-
V. damsela	-	++	-	+
V. metschnikovii	(+)	-	-	+
V. harveyi (carchariae)	-	+	-	-
Примечание: "+++" - часто встречается; "++" - менее часто; "+" - редко; "(+)" - описаны, но этиологическая роль инфекции не была подтверждена; "-" - нет сообщений

2.4. V. parahaemolyticus. Среди галофильных вибрионов по частоте и тяжести вызываемых ими острых кишечных заболеваний особое место занимают парагемолитические вибрионы ². Впервые вспышка пищевой токсикоинфекции, обусловленной V. parahaemolyticus, при которой из 272 заболевших умерло 20, зарегистрирована в Японии в 1950 г. Заболевание было связано с употреблением в пищу слабосоленой рыбы. Парагемолитические вибрионы в Японии обусловливают до 70 % случаев пищевых токсикоинфекций в летние месяцы. Заболевания, вызванные парагемолитическими вибрионами, зарегистрированы также во многих странах Европы, Азии, Америки, Африки, в Австралии и Новой Зеландии. Опасность заражения парагемолитическими вибрионами существует везде, где население использует в питание продукты моря [11]. Вспышки заболеваний возникают в теплое время года в основном в прибрежных районах, но могут встречаться и в местах, удаленных от побережья, что связано с завозом инфицированных продуктов моря. Инкубационный период колеблется от 1 до 96 ч.

------------------------------

²_{Код А 05.3 по Международной классификации болезней МКБ-10.}

------------------------------

Заболевания, вызываемые парагемолитическими вибрионами протекают в виде одной из трех клинических форм: гастроэнтеритической, дизентерие- и холероподобной. Основные симптомы - абдоминальная схваткообразная боль, диарея, тошнота, рвота, головная боль, озноб, повышение температуры тела до температуры плюс 38 - 39 °C. Для гастроэнтеритической формы характерен жидкий водянистый стул без примеси слизи и крови; для дизентериеподобной - стул с примесью слизи и крови; для холероподобной - стул очень частый и обильный, частая рвота, обезвоживание организма. Течение болезни среднетяжелое, но явления интоксикации даже при легких формах выражены. Продолжительность заболевания от нескольких часов до 10 - 15 дней. Летальные исходы наблюдаются редко. Известны случаи инфицирования V. parahaemolyticus ран, ушей, связанные с пребыванием в морской воде. Имеются сообщения о пневмонии, хроническом посттравматическом отите, вызванных V. parahaemolyticus.

Патогенность V. parahaemolyticus связывается с термостабильным прямым гемолизином (англ. thermostable direct hemolysin, далее - TDH), TDH-родственным гемолизином (англ. TDH-related hemolysin, далее - TRH), системами секреции 3 и 6 типа ("the type III, VI secretion") - T3SS, T6SS [7, 18, 19].

В основу серологической классификации парагемолитических вибрионов положены различия в строении О- и К-антигенов. Известно 12 типов О-антигена и 66 К-антигена. Каждый К-антиген сочетается с одним и тем же О-антигеном, образуя ту или иную серогруппу [17].

В Российской Федерации парагемолитические вибрионы обнаружены в морях, соленых озерах и продуктах моря [1, 3 - 4]. Случаи заболевания регистрировались в 1984 - 2019 гг. в прибрежных районах Черного и Японского морей [2, 6, 8]. При групповых заболеваниях от больных чаще выделяли вибрионы серогрупп О4:К12, О4:К8, О3:К6, при спорадических случаях - О3:К33, О3:К57, О5:К47, О6:К46, О10:К52. В 1996 - 2000 гг. парагемолитические вибрионы серогруппы О3:К6, обозначенные как "пандемичный клон", явились причиной крупных вспышек пищевой токсикоинфекции в Японии, республике Корее, на Тайване, в США, в странах Юго-Восточной Азии (Индия, Бангладеш, Лаос, Таиланд) и в Российской Федерации на Дальнем Востоке [12 - 15, 21].

2.5. Галофильные вибрионы видов V. fluvialis, V. furnissii, V. hollisae (Grimontia hollisae), обусловливающие диарейные заболевания, менее значимы в патологии человека. К группе галофильных вибрионов, которые вызывают преимущественно септицемии или раневые инфекции, относят V. vulnificus, V. alginolyticus, V. damsela [9].

V. vulnificus широко распространен в прибрежных морских водах. V. vulnificus вызывает у людей первичный сепсис, раневые инфекции и сравнительно редко острые кишечные заболевания. Синдром первичного сепсиса развивается после употребления в пищу сырых моллюсков, как правило, у лиц с иммунодефицитом и ослабленных хроническими заболеваниями, особенно печени. Быстроразвивающаяся септицемия сопровождается лихорадкой, ознобом, гипотензией, появлением на коже вторичных очагов воспаления вплоть до некроза мягких тканей. Более чем в 50 % случаев первичная септицемия заканчивается летально.

Раневые инфекции возникают зачастую после контакта с морской водой или при разделке морских гидробионтов. Заболевание сопровождается геморрагической сыпью, лихорадкой, отеком, воспалением подкожной клетчатки (целлюлитом) и некрозом в месте заражения. Возможные исходы заболевания - хирургическое удаление пораженной ткани, ампутация конечностей, вторичная септицемия и гибель больного.

Острые кишечные инфекции, обусловленные V. vulnificus, встречаются гораздо реже двух указанных выше форм и заканчиваются преимущественно выздоровлением. Известны случаи менингита и пневмонии, этиологическими факторами которых явились вибрионы этого вида.

V. alginolyticus первоначально классифицирован как биовар V. parahaemolyticus. Известен как возбудитель раневых и реже кишечных инфекций. Заболевания протекают в легкой форме.

V. damsela. Случаи раневых инфекций, вызванные V. damsela, как правило, связаны с пребыванием в морской воде. Эти микроорганизмы выделены из раны рыб Damselfish, откуда и произошло их название. Описан случай септицемии у человека, порезавшего руку во время разделки рыбы.

V. metschnikovii обнаружен в пресных и соленых водоемах, выделен из сточных вод. Описан случай холецистита, осложненный септицемией, вызванный V. metschnikovii.

Патогенные вибрионы видов V. cincinnatiensis, V. harveyi (V. carchariae) описаны в 80 - 90-х годах. Имеются единичные сообщения о заболеваниях, обусловленных ими.

V. mimicus до 1981 года считали сахарозонегативным вариантом V. cholerae. Проведенные таксономические исследования позволяют отнести их в отдельный вид, который получил свое название (mimicus - подобный) из-за сходства с холерными вибрионами. V. mimicus вызывает у людей преимущественно диареи, реже раневые инфекции, эндометрит. Заболевания с поражением желудочно-кишечного тракта связываются с употреблением в пищу сырых продуктов моря, а инфицирование мягких тканей - с пребыванием в морской воде.

III. Бактериологическая диагностика заболеваний, обусловленных патогенными для человека вибрионами

3.1. При проведении диагностических исследований следует иметь в виду, что группами риска в возникновении заболеваний, обусловленных патогенными вибрионами, являются рыбаки, работники рыбообрабатывающих предприятий, жители прибрежных районов умеренного и жаркого климата. Среди них наиболее подвержены заболеваниям лица с ослабленным иммунным статусом или с хроническими заболеваниями, особенно печени.

Исследование клинического материала на различные виды патогенных вибрионов проводят по схеме (см. гл. 3, п. 3.3, рис. 1, табл. 3) в случаях:

- возникновения спорадических или групповых острых кишечных заболеваний по типу пищевой токсикоинфекции, связанных с употреблением в пищу морепродуктов, ловлей и обработкой рыбы или купанием в море в дополнение к лабораторным исследованиям по регламентированным методикам на наличие возбудителя холеры и патогенных энтеробактерий;

- выявления больных септицемией, менингитом, с инфицированными ранами мягких тканей, с инфекцией уха, особенно среди лиц из групп риска, в дополнение к лабораторным исследованиям на наличие возбудителей гнойно-септических инфекций.

Исследования проводят в бактериологических лабораториях в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³.

------------------------------

³_{Пункт 298 СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21).}

------------------------------

3.2. Отбор и доставка материала на исследование.

Материал от больного забирает медицинский персонал медицинской организации немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Исходя из многообразия клинических проявлений заболеваний исследуют различный материал.

От больных острыми кишечными инфекциями исследуют испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка. Применяют методы отбора и доставки материала, принятые в практике бактериологической диагностики холеры ⁴.

------------------------------

⁴_{Пункт 4.2 МУК 4.2.3745-22 "Методы лабораторной диагностики холеры", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 12.05.2022 (далее - МУК 4.2.3745-22).}

------------------------------

От больных с раневой инфекцией исследуют отделяемое ран; при септицемии, менингите - кровь, спинномозговую жидкость (далее - СМЖ). В случаях заболеваний с внекишечной локализацией возбудителя применяют методы отбора и доставки материала, принятые в практике бактериологической диагностики соответствующих заболеваний ⁵.

------------------------------

⁵_{Пункт 6 МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортировки биоматериалов в микробиологической лаборатории", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23.12.2005.}

------------------------------

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк-направление и помещают в контейнер для транспортировки биологического материала на исследование.

При санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи исследуют пищевые продукты, воду открытых водоемов, гидробионты в соответствии с методическим документом ⁶.

------------------------------

⁶_{МУК 4.2.2046-06 "Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе, нерыбных объектах промысла, продуктах, вырабатываемых из них, воде поверхностных водоемов и других объектах", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 30.01.2006 (далее - МУК 4.2.2046-06).}

------------------------------

Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают в стерильную посуду или на стерильную бумагу, фольгу с помощью стерильных инструментов (ножа, пинцета, ложки, пробоотборника).

Морскую воду для исследования отбирают в объеме 1,0 л в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.

В лабораторию пробы доставляются в течение двух часов. Исследование проб начинают немедленно после доставки. Исследования проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁷.

------------------------------

⁷_{Глава IV СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

3.3. Порядок исследования.

Материал от больных исследуют по схеме, представленной на рис. 1 и табл. 3. Предлагаемая схема предусматривает выделение галофильных и негалофильных вибрионов. Для выделения и идентификации вибрионов используют жидкие и плотные питательные среды, содержащие 1,5 % натрия хлорида. При исследовании только на галофильные вибрионы концентрацию натрия хлорида в средах рекомендуется увеличить до 2 - 3 %.

Рис. 1. Схема бактериологического исследования материала от больных и ООС на патогенные для человека вибрионы

Примечание: * параллельно проводятся исследования на наличие патогенных энтеробактерий; ** параллельно проводится исследование на наличие возбудителей гнойно-септических инфекций; *** MALDI-TOF масс-спектрометрическое исследование проводится при наличии в лаборатории оборудования, при отсутствии идентификация осуществляется на основании фенотипических признаков.

Для бактериологического исследования используют следующие питательные среды: жидкие среды накопления, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и среды или тест-системы для идентификации, а также консерванты коммерческого производства, зарегистрированные в установленном порядке. Используемые для диагностики питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке. Идентификация вибрионов по биохимической активности может быть проведена с использованием микробиологических анализаторов (приложение 2 к настоящим МУК).

3.3.1. Первый день исследования. Рвотные массы, промывные воды желудка, фекалии в количестве 1 - 2 г (мл) вносят в 50 мл 1 %-й пептонной воды с 1,5 % натрия хлорида; кровь, спинномозговую жидкость - по 1,0 мл в 9 мл той же среды; отделяемое ран, взятое стерильным тампоном, помещают в пробирку с 10 мл накопительной среды. Посевы рвотных масс, содержимого желудка, фекалий и отделяемого ран инкубируют 6 - 8 ч при температуре (37,00,5) °C, крови - 18 - 20 ч при той же температуре.

Таблица 3

Этапы исследования материала от больных и ООС на патогенные для человека вибрионы

1 - 2-й день	1. Посев исследуемого материала на первую среду обогащения (1 % п.в. с 1,5 % NaCl). 2. Через 6 - 8 ч от начала исследования пересев на вторую среду обогащения. Посев на щелочной агар (Щ.А.) и на одну из селективных сред (С.С.) нативного материала, из первой и второй пептонной воды. 3. Отбор колоний, подозрительных на вибрионы, с посевов предыдущего дня: а) подозрительные на холерные вибрионы колонии агглютинируют холерными O1 и O139 сыворотками, в случае положительного результата проводят исследования, направленные на выделение возбудителя холеры; б) подозрительные на другие виды вибрионов колонии на щелочном агаре и селективной среде отсевают одной петлей на полиуглеводную среду (далее - ПУС), дифференциально-диагностическую среду (далее - ДДС) и в 1 %-ю пептонную воду без NaCl. 4. Идентификация культур с использованием масс-спектрометрии. 5. Постановка ПЦР для идентификации видовой принадлежности. 6. В случае положительного результата - выдача окончательного ответа
3-й день	1. Изучение посевов со 2-й среды обогащения и выделение подозрительных культур проводят так же, как и с 1-го пептона. 2. Учет роста в 1 %-й пептонной воде без NaCl, на ПУС и ДДС. Постановка пробы на индофенолоксидазу с культурой с ПУС, с дифференциально-диагностический среды и реакция агглютинации с холерными O1 и O139 сыворотками на стекле с культурами, выросшими в 1 %-й пептонной воде без NaCl и давшие характерные изменения на ПУС и дифференциально-диагностических средах. 3. Изучение морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму. 4. Посев отобранных культур (галофильных вибрионов) на дифференциально-диагностические среды, содержащие 1,5 % NaCl
4 - 5-й день	1. Учет результатов тестов идентификации. Определение вида выделенных культур вибрионов. 2. Идентификация культур, выделенных со второго пептона. 3. Определение чувствительности культур к антибиотикам. 4. Учет результатов исследования. Выдача окончательного ответа

Материал от больных, исключая кровь, одновременно засевают на щелочной агар и одну из селективных сред. Через 6 - 8 ч от начала исследования делают пересев на вторую среду обогащения, для чего материал из первой среды переносят петлей диаметром 5 мм в 10 мл 1 %-й пептонной воды с 1,5 % натрия хлорида и инкубируют при комнатной температуре до следующего дня или 6 - 8 ч при температуре (37,00,5) °C. Из первой пептонной воды делают высев на щелочной агар, а при исследовании отделяемого ран, крови, СМЖ по истечении сроков инкубации и на агар с 5 % крови барана. На этой среде вибрионы, за исключением гемолитических штаммов V. cholerae O1 и V. damsela, не проявляют гемолитической активности.

3.3.2. Второй день исследования. Пересевают материал со 2-го пептона, а при исследовании крови - с первого на щелочной агар и одну из селективных сред. Просматривают невооруженным глазом посевы на плотных средах. Холерные вибрионы на щелочном агаре образуют прозрачные голубоватые колонии. Вибрионы других видов формируют полупрозрачные и плотные колонии размером от 1 - 1,5 мм у таких видов, как V. mimicus, V. damsela, и более крупные (от 2 до 5 мм) - у остальных видов патогенных вибрионов. На агаре тиосульфат-цитрат-желчные соли-сахароза (англ. Thiosulfate Citrate Bile Sucrose, далее - TCBS) колонии вибрионов гладкие с ровным краем, желтоватые или цвета среды, в зависимости от отношения к сахарозе, и достигают в размере 2 - 6 мм.

Колонии вибрионов проверяют на наличие индофенолоксидазы. Все патогенные виды вибрионов, кроме V. metschnikovii, а также аэромонады, псевдомонады, в отличие от энтеробактерий, дают положительные результаты в этом тесте.

С подозрительными на холерные вибрионы колониями ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с холерными O1 и O139 сыворотками. В случае положительного результата их изучают в соответствии с методическими документами ⁸.

------------------------------

⁸_{Пункт 4.5 МУК 4.2.3745-22.}

------------------------------

Подозрительные колонии идентифицируют методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Идентификацию культур можно проводить методом ПЦР согласно инструкции.

В случае положительного результата - выдача окончательного ответа. При отсутствии в лаборатории масс-спектрометра и оборудования для проведения ПЦР-анализа идентификацию выделенных культур проводят традиционными биохимическими методами, основанными на детекции ферментативной активности бактерий.

Оксидазопозитивные и оксидазонегативные колонии отсевают на полиуглеводную среду (например, Ресселя, Клиглера), ДДС и в пептонную воду без добавления натрия хлорида.

3.3.3. Третий день исследования. Изучают посевы со 2-го пептона так же, как и с первого. Учитывают наличие роста в 1 %-й пептонной воде без натрия хлорида, на дифференциально-диагностических средах и характер изменения окраски полиуглеводной среды.

Ставят пробу на индофенолоксидазу и изучают морфологию клеток в мазках с полиуглеводной среды, окрашенных по Граму. Для дальнейшего исследования отбирают грамнегативные культуры:

- оксидазопозитивные, дающие характерные изменения на полиуглеводной среде, выросшие и не выросшие в 1 %-й пептонной воде без натрия хлорида;

- оксидазопозитивные, ферментирующие глюкозу с образованием газа, выросшие и не давшие роста в пептонной воде без соли;

- оксидазонегативные, расщепляющие глюкозу до кислоты без газа, независимо от роста в 1 %-й пептонной воде, не содержащей натрия хлорида.

Среди культур первой группы, выросших в 1 %-й пептонной воде без натрия хлорида, могут быть негалофильные вибрионы: V. cholerae, V. mimicus, а также бактерии р. Aeromonas, р. Plesiomonas и некоторые штаммы V. fluvialis. Культуры, не выросшие в 1 %-й пептонной воде без натрия хлорида, подозрительны на принадлежность к галофильным вибрионам.

Среди культур второй группы возможны отдельные штаммы V. damsela, V. furnissii, ферментирующие глюкозу с образованием газа.

В третьей группе культур могут оказаться V. metschnikovii, а также не образующие газ энтеробактерии.

С оксидазопозитивными культурами, выросшими в пептонной воде без соли и дающими на полиуглеводной среде характерные для вибрионов изменения, ставят ориентировочную реакцию агглютинации с холерными O1 и O139 сыворотками в разведении 1:50. В случае положительного результата их изучают в соответствии с методическими документами ⁹.

------------------------------

⁹_{Пункт 4.5 МУК 4.2.3745-22.}

------------------------------

Все остальные отобранные культуры отсевают на дифференциально-диагностические среды и среды для идентификации для изучения признаков, указанных в табл. 1.

3.3.4. Четвертый день исследования. Учитывают изменения в средах, засеянных в предыдущий день. Культуры, выделенные со 2-го пептона, изучают по плану 3-го дня исследования. По тестам идентификации определяют видовую принадлежность культур, выделенных из первого пептона.

У выделенных от больных культур вибрионов определяют антибиотикограмму. В специализированных лабораториях парагемолитические вибрионы изучают методами серо- и фаготипирования и определяют факторы патогенности.

3.3.5. Пятый день исследования. Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ.

При выявлении в прибрежных морских зонах спорадических или групповых случаев заболевания, обусловленных парагемолитическими или другими патогенными для человека вибрионами, а также при возникновении неблагоприятной экологической ситуации проводят исследование воды открытых водоемов и обитающих в них гидробионтов, а также свежевыловленных гидробионтов в местах их организованной и неорганизованной реализации в соответствии с методическими документами ¹⁰.

------------------------------

¹⁰_{МУК 4.2.2046-06.}

------------------------------

3.4. Идентификация культур патогенных вибрионов.

Выделенные культуры идентифицируют с целью определения принадлежности к одному из видов рода Vibrio. Предварительную идентификацию выделенных вибрионов на галофилы и негалофилы проводят в тесте на галофильность.

Наличие индофенолоксидазы и потребность в натрии хлориде отличает вибрионы от представителей семейства Enterobacteriaceae. Аэромонады, в отличие от вибрионов, не нуждаются в натрии хлориде, но устойчивы к O/129. Некоторые штаммы р. Plesiomonas чувствительны к вибриостатику O/129, но в отличие от вибрионов обладают лизиндекарбоксилазой и аргининдигидролазой.

Дальнейшая межвидовая дифференциация вибрионов возможна с помощью дифференцирующих тестов, указанных в табл. 1, или с использованием идентификационного ключа (рис. 2).

Ключ состоит из трех частей. В первой предусмотрена дифференциация негалофильных вибрионов: V. cholerae не O1, V. mimicus, а также негалофильных штаммов V. metschnikovii и V. fluvialis. Штаммы V. metschnikovii, в отличие от других микроорганизмов этой группы, не имеют индофенолоксидазы и нитратредуктазы. Отличительным признаком V. fluvialis является наличие аргининдигидролазы при отсутствии лизиндекарбоксилазы; V. cholerae не O1 и V. mimicus дифференцируют по отношению к сахарозе.

Во второй части ключа дана схема дифференциации галофильных вибрионов, не образующих газ из глюкозы: V. vulnificus, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. hollisae (Grimontia hollisae) и некоторых штаммов V. fluvialis, V. metschnikovii. Тестами, позволяющими дифференцировать вибрионы этой группы, являются: ферментация сахарозы, образование ацетилметилкарбинола, наличие лизиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы, бета-галактозидазы. Наибольшую сложность представляет дифференциация V. vulnificus и V. parahaemolyticus. V. vulnificus, в отличие от V. parahaemolyticus, ферментируют целлобиозу, салицин и обладают бета-галактозидазой.

Третья часть ключа полезна для дифференциации галофильных вибрионов, ферментирующих глюкозу с образованием газа, которая возможна по результатам изучения ферментации арабинозы, сахарозы, маннита и способности образовывать ацетилметилкарбинол.

3.5. Идентификация культур патогенных вибрионов с использованием метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетным разделением ионов (англ. Matrix assisted laser desorption / ionization - time of flight, далее - MALDI-ToF) масс-спектрометрии.

MALDI-ToF - метод мягкой ионизации, позволяющий ионизировать биологические макромолекулы в присутствии особого вещества, т.н. "матрицы", под воздействием лазера. Полученные ионы, преимущественно однозарядные, ранжируются во времяпролетной системе разделения за счет разной скорости перемещения, обратно пропорциональной массе иона. Зная длину пути перемещения иона от ионизатора до детектора, а также время этого перемещения, можно вычислить скорость движения иона и, на основании ее значения, рассчитать массу частицы. Использование в качестве исследуемого образца чистой культуры микроорганизма или его экстрактов позволяет получить спектр, характеризующий качественный молекулярный состав исследуемого объекта [16, 20].

Рис. 2. Дифференциация вибрионов, патогенных для человека (идентификационный ключ)

Получаемый спектральный паттерн является уникальной характеристикой, позволяющей однозначно идентифицировать микроорганизм до вида, а в некоторых случаях осуществить и внутривидовую дифференциацию. Собранные в процессе анализа спектры исследуемых микроорганизмов могут сравниваться с референсными спектрами, присутствующими в базе данных, поставляемых производителями вместе с оборудованием для MALDI-TOF MS. При определенном проценте совпадений выводится результат о таксономической принадлежности исследуемого объекта.

Работа в микробиологической лаборатории на MALDI-TOF масс-спектрометре выполняется в соответствии с методическими документами ¹¹.

------------------------------

¹¹_{Пункт 3 МР 4.2.0089-14 "Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) для индикации и идентификации возбудителей I - II групп патогенности", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24.04.2014.}

------------------------------

3.5.1. Подготовка культур микроорганизмов.

Для масс-спектрометрического анализа используются только чистые культуры или изолированные колонии микроорганизмов. Если в исследуемом образце содержатся микроорганизмы более чем одного вида, то идентификация пройдет некорректно.

Для культивирования вибрионов используются общепринятые плотные щелочные среды (щелочной агар, агар Мартена, LB агар). Добавление натрия хлорида до 1,5 % не влияет на качество спектров и результат идентификации. Нельзя использовать селективные среды, содержащие индикаторы (TCBS); если культура микроорганизма выделена с использованием указанных селективных сред, ее необходимо пересеять на щелочной агар. Для получения максимально воспроизводимых результатов лучше анализировать культуру в поздней логарифмической или стационарной фазе роста (через 18 - 24 часа).

Для микроорганизмов III - IV групп патогенности используют метод прямого нанесения образцов на мишень:

- одну изолированную колонию возбудителя захватывают одноразовой микробиологической петлей (нельзя использовать металлические петли) и равномерно наносят на лунку MSP-чипа, не выходя за края. Для каждой исследуемой единицы (колония, штамм) используют 3 - 5 лунок для получения достоверного результата;

- сразу после высыхания нанесенной на чип биомассы сверху наносят матрицу;

- на контрольную лунку MSP-чипа наносят калибровочный стандарт для масс-спектрометрии, на который также после высыхания наносят матрицу. Необходимо дождаться высыхания раствора матрицы, после чего можно приступать к масс-спектрометрическим исследованиям. Количество наносимой матрицы и калибровочного стандарта берут согласно инструкции к масс-спектрометру;

- после проведения мероприятий по заключительной дезинфекции рабочей зоны бокса 70 % спиртом чип с нанесенными на него образцами может быть перенесен для дальнейшего анализа в зону, где не проводят непосредственную работу с ПБА.

Приготовление раствора матрицы также производят согласно инструкции к масс-спектрометру.

3.5.2. Проведение MALDI-ToF масс-спектрометрии, учет и интерпретация результатов.

Идентификацию проводят на масс-спектрометрах с использованием установленных программных продуктов. На первом этапе идентификации производят сбор исходных спектров исследуемых образцов.

Для получения достоверных результатов идентификации с каждого образца необходимо получить не менее пяти исходных спектров. Следующий этап - автоматическая идентификация на основании сравнения собранных исходных спектров с референсными спектрами базы данных. По окончании процесса идентификации программа отображает результат идентификации, приводя наиболее ревалентную исходному спектру таксономическую единицу базы данных.

3.6. Молекулярно-генетическая идентификация патогенных вибрионов с использованием ПЦР.

Для проведения реакции используется 1 млрд взвесь культур микроорганизмов в дистиллированной воде, согласно отраслевому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей (ОСО 5МЕ). Из обеззараженных в соответствии с методическими документами ¹² взвесей проводят выделение ДНК с помощью зарегистрированного в установленном порядке набора реагентов для выделения ДНК/РНК. ПЦР проводят согласно инструкции, прилагаемой к набору реагентов.

------------------------------

¹²_{МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009.}

------------------------------

IV. Методы определения дифференциальных признаков патогенных вибрионов

4.1. Вибриостатический тест.

Для постановки теста используют диски, содержащие 10 и 150 мкг вибриостатика O-129 (2,4-diamino 6,7-diisopropylpteridine phosphate). Суспензией суточной агаровой культуры исследуемого штамма равномерно засевают пластинку щелочного агара, на газон накладывают диски, инкубируют в течение 18 - 20 ч и учитывают результаты. Любая зона ингибиции роста вокруг дисков рассматривается как положительный результат. В отличие от представителей р. Aeromonas и р. Pseudomonas негалофильные вибрионы чувствительны к вибриостатику. Галофильные вибрионы ведут себя по-разному (табл. 1).

4.2. Выявление способности к роению.

Феномен роения используется для дифференциации алгинолитических и парагемолитических вибрионов на 1,5 %-ом агаре с 3 % натрия хлорида. Алгинолитические вибрионы, в отличие от парагемолитических, растут в виде сплошного налета, напоминающего рост вульгарного протея. Для выявления феномена роения суточную агаровую культуру наносят в центр подсушенной пластины щелочного агара и сутки инкубируют при температуре (370,5) °C. Роящиеся культуры распространяются по поверхности всей среды, а нероящиеся вырастают только на месте посева.

4.3. Определение подвижности.

Подвижность определяют при микроскопировании раздавленной капли с помощью фазово-контрастного устройства или посевом в 0,3 %-й мясопептонный агар (МПА) с 3 % натрия хлорида.

4.4. Определение галофильности и солевой толерантности.

Рост в пептонной воде с 1 % натрия хлорида. Суточную агаровую культуру засевают в 1 %-ю пептонную воду с 1 % натрия хлорида. Через 3 - 4 ч инкубации при температуре (370,5) °C переносят строго по 1 капле выросшей культуры в пептонную воду без соли и с 3, 6, 8 и 10 % натрия хлорида. Через 18 - 20 ч инкубации оценивают рост по помутнению среды.

Пептонную воду готовят из сухих компонентов без натрия хлорида и с внесением в нее необходимой навески соли. Негалофильные вибрионы растут в отсутствии соли в среде. Галофильные вибрионы не растут в 1 %-й пептонной воде без добавления натрия хлорида и устойчивы к различным его концентрациям.

Предварительную идентификацию по данному признаку можно проводить с использованием зарегистрированных в установленном порядке коммерческих препаратов с селективными и идентифицирующими добавками для галофильных вибрионов в соответствии с прилагаемой инструкцией.

4.5. Биохимические свойства.

Тип расщепления глюкозы, декарбоксилазную активность, ферментацию углеводов и спиртов, гидролиз мочевины, образование индола, сероводорода определяют с использованием общепринятых питательных сред, содержащих 1,5 % натрия хлорида. С целью сокращения срока и повышения качества проведения исследования, одновременно сократив материальные и трудовые затраты, целесообразно применение на данном этапе микрообъемных технологий (наборов систем индикаторных бумажных (далее - СИБ) для идентификации вибрионов или специальных микротест-систем, зарегистрированных в установленном порядке) и микробиологических анализаторов.

4.5.1. Определение цитохромоксидазы.

Принцип метода: в присутствии цитохромоксидазы N,N-диметил-1,4-фенилендиамин вступает в цветную реакцию альфа-нафтолом с образованием индофенолового синего. Для постановки теста используют коммерческие тесты или бумажные полоски из наборов СИБ для идентификации микроорганизмов (набор N 1 для вибрионов; набор N 2 для межродовой дифференциации энтеробактерий). На обработанную реактивом полоску бумаги наносят платиновой петлей, деревянной или стеклянной палочкой исследуемую культуру. При появлении красного или синего окрашивания через 30 - 60 секунд реакцию считают положительной.

Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на цитохромоксидазу дают вибрионы, аэромонады, плезиомонады, а отрицательную - энтеробактерии.

4.5.2. Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью-Лейфсона).

В две пробирки со средой Хью-Лейфсона засевают уколом в столбик изучаемую культуру. Поверхность среды в одной из пробирок покрывают 0,5 - 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют от 1 до 4 суток при температуре (37,00,5) °C. Окисление определяют по желтой окраске среды только в аэробных, ферментацию - в аэробных и анаэробных условиях роста. Вибрионы расщепляют глюкозу по ферментативному типу.

4.5.3. Определение декарбоксилазной и дигидролазной активности.

В пробирки со средами, содержащими лизин, орнитин, аргинин и контрольную среду без аминокислот, засевают по полной петле 18-часовой культуры и заливают 0,5 - 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Инкубируют посевы при температуре (37,00,5) °C. Учет результатов проводят ежедневно, при сомнительном результате наблюдение продлевают до 4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг pH в кислую сторону, а в дальнейшем при гидролизе аминокислот накапливаются амины, и происходит защелачивание среды.

4.5.4. Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (например, глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР. Для посева используют культуру, выращенную в течение 12 - 20 ч на плотной питательной среде или в течение 3 - 4 ч - в жидкой питательной среде. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при температуре плюс (37,00,5) °C и учитывают через 6 - 18 ч.

4.5.5. Определение бета-галактозидазы.

Суточную агаровую культуру засевают на скошенную поверхность агара, содержащего 10 % лактозы. Посевы инкубируют 1 - 2 суток при температуре плюс (370,5) °C. Петлю культуры суспендируют в 0,25 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида, добавляют 0,25 мл водного раствора ортонитрофенил-бета-D-галактопиранозида (англ. O-Nitrophenyl--D-galactopyranoside, далее - ONPG) и помещают в термостат при температуре плюс (370,5) °C. Для приготовления раствора ONPG 80 мг вещества растворяют в 15 мл дистиллированной воды при температуре 37 °C. Затем добавляют 5 мл фосфатного буфера и доводят pH до 7,0. Раствор должен быть бесцветным. Хранят его при температуре 4 °C. Перед использованием выдерживают несколько минут при температуре 37 °C до растворения фосфата, который на холоде кристаллизуется. Реакцию учитывают через 20 мин., 1, 3 и 24 ч. В положительном случае взвесь приобретает желтую окраску, отрицательном - остается бесцветной.

4.5.6. Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол).

Культуру засевают в глюкозофосфатный бульон Кларка и инкубируют при температуре (370,5) °C в течение 1 - 3 суток. Затем к 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 6 %-го спиртового раствора альфа-нафтола и 0,4 мл 40 %-го раствора едкого калия. Пробирки встряхивают и помещают на 1 ч в термостат. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или красный цвет.

4.5.7. Определение нитратредуктазы:

- суточную агаровую культуру засевают в 1 мл бульона Хоттингера с 0,1 % калия азотнокислого. После 2-х суток инкубации при температуре (370,5) °C в посевы добавляют 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях среда сразу же окрашивается в красный цвет;

- к 1 - 2-суточной культуре в бульоне Хоттингера с 0,1 % KNO ₃ добавляют 3 - 5 капель реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1 %-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12 %-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции бульон окрашивается в красный цвет.

4.5.8. Определение образования индола.

Большинство представителей р. Vibrio при выращивании в средах, содержащих триптофан (например, пептонная вода, мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера), расщепляют его с образованием индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек или реактива Эрлиха после инкубирования при температуре плюс (37,00,5) °C в течение 18 ч.

4.5.9. Определение образования сероводорода.

Вибрионы не продуцируют фермент тиосульфатредуктазу, т.е. не способны расщеплять неорганические серосодержащие соединения, присутствующие в среде Клиглера и маннозо-сахарозной среде - это является дифференциальным признаком. Однако они так же, как некоторые другие энтеробактерии, продуцируют фермент цистиндесульфогидролазу, за счет которого способны образовывать сероводород из серосодержащих аминокислот, присутствующих в достаточном количестве в бульоне Хоттингера, мясо-пептонном бульоне, но отсутствующих или содержащихся в незначительном количестве в 1 %-й пептонной воде. Поэтому для постановки этого теста культуры выращивают в 1 %-й пептонной воде при температуре (37,00,5) °C в течение 18 - 20 ч. Образование сероводорода регистрируют с помощью индикаторных бумажек.

4.6. Определение патогенных свойств парагемолитических вибрионов.

Ключевыми факторами патогенности V. parahaemolyticus являются TDH и родственный ему TRH [18, 19].

4.6.1. Феномен Канагава.

Термостабильный прямой гемолизин обусловливает лизис эритроцитов человека и кролика на среде Вагатцума, что получило название феномена Канагава (КР). По результатам этого теста парагемолитические вибрионы делят на КР-позитивные (вирулентные), образующие зону -гемолиза на кровяном агаре, и КР-негативные (авирулентные), не лизирующие эритроциты человека.

На свежеприготовленный агар Вагатцума наносят по капле суточной бульонной культуры исследуемого и контрольного штаммов. Посевы инкубируют при температуре плюс (370,5) °C. Для контроля гемолитической активности используют тест-штамм V. parahaemolyticus КМ-187 (позитивный контроль) и V. parahaemolyticus КМ-215 (негативный контроль) ¹³.

------------------------------

¹³_{Штаммы  V. parahaemolyticus КМ-186, КМ-187 и КМ-215 депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора.}

------------------------------

Результаты учитывают через 24 - 48 часов по величине и характеру зоны гемолиза. За положительный результат принимают зону четкого лизиса, размером 3 мм и более. При зоне менее 3 мм результат оценивают как слабо положительный. К этой группе относят также штаммы с неполным гемолизом, который в различных повторностях может варьировать по интенсивности и величине зоны просветления. При отсутствии лизиса штаммы считают Канагава-негативными.

Парагемолитические вибрионы, выделенные от больных, как правило, Канагава-позитивны и содержат tdh ген. К группе со слабовыраженной гемолитической активностью относятся штаммы с низким уровнем экспрессии tdh гена, что отмечено у вибрионов, имеющих одну копию гена tdh, и у штаммов, содержащих одновременно гены tdh и trh.

Предварительную идентификацию вибрионов по данному признаку проводят на первый день исследования с использованием агара с 5 % крови барана.

4.6.2. Уреазная активность.

Гидролитический фермент уреаза является фактором патогенности для многих микроорганизмов [5]. Уреазопозитивные штаммы парагемолитических вибрионов выделяют от больных гастроэнтеритом. Все уреазопозитивные штаммы, как правило, содержат ген trh, детерминирующий синтез TDH-подобного гемолизина. Наличие уреазной активности может служить косвенным признаком присутствия одного из ключевых факторов патогенности V. parahaemolyticus - trh гена.

Для постановки теста суточную агаровую культуру высевают петлей на скошенную поверхность среды Кристенсена. Результат учитывают через 24 - 48 часов инкубации при температуре 37 °C. При положительном результате среда окрашивается в малиновый цвет. В качестве контрольного используют уреазопозитивный тест-штамм V. parahaemolyticus КМ-186 и уреазонегативный - V. parahaemolyticus КМ-215.

4.6.3. Тест-штаммы для определения вирулентности V. parahaemolyticus.

С целью стандартизации описанных методов в качестве контрольных предложены следующие тест-штаммы парагемолитических вибрионов:

- V. parahaemolyticus КМ-187, серогруппа О5:К15, Канагава-позитивный, tdh ⁺trh ^- штамм. Используется при оценке гемолитической активности парагемолитических вибрионов по способности лизировать эритроциты человека на среде Вагатцума;

- V. parahaemolyticus КМ-186, серогруппа О1:К25, tdh ^-trh ⁺ - тест-штамм (позитивный контроль) для оценки уреазной активности. Вибрионы этого штамма обладают выраженной и стабильно проявляемой уреазной активностью;

- V. parahaemolyticus КМ-215 - Канагава-негативный, не продуцирующий уреазу, не содержащий гены tdh и trh. Используют в качестве негативного контроля при оценке гемолитической, уреазной активности, а также при ПЦР-тестировании генов tdh, trh.

Перечисленные штаммы могут быть получены из коллекционного фонда исследовательских или государственных коллекций микроорганизмов ¹⁴ в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹⁵.

------------------------------

¹⁴_{Пункт 10, 16 постановления Правительства Российской Федерации от 30.09.2021 N 1668 "Об утверждении Правил создания, пополнения, ведения и использования коллекций патогенных микроорганизмов и вирусов, а также Правил создания и ведения национального каталога коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов и вирусов".}

¹⁵_{Пункт 512 СанПиН 3.3686-21.}

------------------------------

V. Питательные среды

5.1. Для лабораторной диагностики парагемолитических и других патогенных для человека вибрионов используют питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке на территории Российской Федерации и прошедшие контроль качества после приготовления.

5.2. Среды накопления и обогащения.

1 %-й пептонной воды с 1,5 % натрия хлорида. Готовят из коммерческого пептона основного, приготовленного в соответствии с инструкцией по его применению с учетом необходимого разведения и исходного содержания в нем натрия хлорида.

5.3. Среды для выделения и культивирования.

Щелочной агар с 1,5 % натрия хлорида. Щелочной агар готовят из сухого коммерческого препарата, зарегистрированного в установленном порядке на территории Российской Федерации и приготовленного в соответствии с инструкцией по его применению с добавлением в ходе приготовления натрия хлорида до 1,5 % с учетом соли, входящей в его состав.

5.4. Селективно-дифференциальные среды предназначены для выделения и культивирования патогенных вибрионов, а также позволяют подавлять рост сопутствующей микрофлоры и дифференцировать колонии вибрионов от колоний других микроорганизмов по их цвету.

5.5. Среды для идентификации парагемолитических и других патогенных для человека вибрионов. Применяют зарегистрированные в установленном порядке сухие или готовые к использованию питательные среды по признакам ферментации углеводов, многоатомных спиртов, аминокислот или сразу по нескольким признакам. Их готовят в соответствии с инструкциями по применению производителей.

5.5.1. Среда Ресселя.

Среду Ресселя можно изготовить из сухого коммерческого препарата, зарегистрированного в установленном порядке на территории Российской Федерации. Данную среду готовят к работе в соответствии с инструкцией по применению производителя. Среду разливают в стерильные пробирки по 7 - 8 мл и стерилизуют в автоклаве при температуре плюс 112 °C 20 минут при 0,5 атм. После стерилизации среду скашивают так, чтобы в каждой пробирке были столбик и скошенная часть.

5.5.2. Среда для определения бета-галактозидазы вибрионов.

Для этой цели используют специальный агар с 10 % лактозы и 1,5 % натрия хлорида. В качестве основы используют сухой коммерческий агар для культивирования микроорганизмов с добавлением 1,5 % натрия хлорида с учетом исходного содержания в нем натрия хлорида и 10 % лактозы. Готовую среду разливают в стерильные, химически чистые пробирки по 7 - 8 мл и стерилизуют при температуре плюс 104 °C 20 мин.

5.5.3. Для постановки реакции Фогес-Проскауэр используют сухой коммерческий глюкозо-фосфатный бульон (Кларка) с добавлением 1,5 % натрия хлорида с учетом исходного содержания в нем натрия хлорида. Готовую среду разливают в стерильные, химически чистые пробирки по 7 - 8 мл и стерилизуют при температуре плюс 104 °C 20 мин.

5.5.4. Пептонная вода 1 %-я с 3, 6, 8, 10 % натрия хлорида (для определения солевой толерантности). Пептонную воду, содержащую натрия хлорид в различной концентрации, можно изготовить из коммерческого пептона основного. Используют внесенный в Государственный реестр медицинских изделий основной пептон сухой, который готовят в соответствии с инструкциями по применению производителей. Основной пептон сухой с истекшим сроком годности использованию не подлежит.

5.6. Среды для определения патогенных свойств парагемолитических вибрионов.

Для определения уреазной активности применяют изготовленный в лабораторных условиях агар Кристенсена с 1,5 % натрия хлорида. Для этой цели используют сухую коммерческую среду Кристенсена с добавлением 1,5 % натрия хлорида с учетом исходного содержания в ней натрия хлорида. Готовый агар стерильно разливают в стерильные, химически чистые пробирки по 7 - 8 мл и охлаждают в наклонном положении. Изготовленный таким образом агар Кристенсена контролируют как среду лабораторного изготовления, т.к. коммерческий препарат не имеет регистрации, как изделие медицинского назначения.

5.6.1. Среда Вагатцума (для изучения гемолитической активности парагемолитических вибрионов). Применяют зарегистрированный в установленном порядке сухой препарат. К приготовленной в соответствии с инструкциями по применению производителя среде добавляют на 100 мл среды 2 мл (приблизительно до 0,5 %) трижды отмытых в физиологическом растворе эритроцитов свежей цитратной крови человека. Тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

5.6.2. Донорская кровь, не соответствующая обязательным требованиям безопасности для клинического применения или неиспользованная ¹⁶, для среды Вагатцума:

------------------------------

¹⁶_{Пункт 3 постановления Правительства Российской Федерации от 12.04.2013 N 331 "Об утверждении Правил обеспечения медицинских, образовательных, научных и иных организаций донорской кровью и (или) ее компонентами в иных целях, кроме клинического использования".}

------------------------------

- донорская кровь - 80 мл;

- цитрат натрия - 2 г;

- глюкоза безводная - 3 г;

- вода дистиллированная - 1 л;

- pH крови в день заготовки 6,9 - 7,1. Раствор стерилизуют в автоклаве при температуре плюс 120 °C 30 минут. Срок хранения - 2 года.

Для предварительной идентификации патогенных свойств вибрионов применяют питательный агар с 5 % крови барана и 1,5 % натрия хлорида. В качестве основы используют сухой питательный агар. В охлажденный до 50 °C агар (100 мл) добавляют 5 мл свежеприготовленных эритроцитов барана, для чего кровь с добавлением цитрата натрия центрифугируют и осадок эритроцитов трижды отмывают физиологическим раствором.

5.7. Контроль питательных сред для выделения вибрионов.

Контроль питательных сред и ингибиторов роста посторонней микрофлоры проводится в соответствии с методическими документами ¹⁷.

------------------------------

¹⁷_{МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008; пункт 6.2 МУК 3.3.2.2124-06 "Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17.08.2006.}

------------------------------

Нормативные и методические документы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 12.04.2013 N 331 "Об утверждении Правил обеспечения медицинских, образовательных, научных и иных организаций донорской кровью и (или) ее компонентами в иных целях, кроме клинического использования".

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.09.2021 N 1668 "Об утверждении Правил создания, пополнения, ведения и использования коллекций патогенных микроорганизмов и вирусов, а также Правил создания и ведения национального каталога коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов и вирусов".

4. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

5. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

6. МУ 5780-91 "Методические указания по контролю в рыбных продуктах парагемолитических вибрионов - возбудителей пищевых токсикоинфекций".

7. МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования материала в микробиологические лаборатории".

8. МУ 3.3.2.2124-06 "Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза".

9. МУК 4.2.3745-22 "Методы лабораторной диагностики холеры".

10. МУК 4.2.3746-22 "Организация и проведение лабораторной диагностики холеры в лабораториях различного уровня".

11. МУК 4.2.2046-06 "Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе, нерыбных объектах промысла, продуктах, вырабатываемых из них, воде поверхностных водоемов и других объектах".

12. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

13. МР 4.2.0089-14 "Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) для индикации и идентификации возбудителей I - II групп патогенности".

14. ГОСТ ISO/TS 21872-1 "Горизонтальный метод обнаружения потенциально энтеропатогенных Vibrio spp. Часть 1. Обнаружение Vibrio parahaemolyticus и Vibrio cholera".

15. ГОСТ 17206 "Агар микробиологический. Технические условия".

16. ГОСТ Р 52501 (ИСО 3696) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

17. ГОСТ 5962 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".

Библиографические ссылки

1. Лаженцева Л.А. Распространенность галофильных вибрионов в морских промысловых объектах и продуктах из них. Обзор / Л.А. Лаженцева // Исследования водных биологических ресурсов Камчатки и северо-западной части Тихого океана. 2012, Вып. 26. С. 33 - 52.

2. Маслов Д.В. Вспышка галофилеза среди населения г. Владивостока Приморского края / Д.В. Маслов // Здоровье населения и среда обитания. 1997. N 12 (57). С. 17 - 18.

3. Полеева М.В. Разработка способа индикации и идентификации Vibrio parahaemolyticus с помощью Real-Time ПЦР / М.В. Полеева, О.С. Чемисова, А.Л. Трухачев // Вестник Пермского университета. Серия "Биология". 2019. Вып. 2. С. 175 - 181.

4. Полеева М.В. Изучение эффективности набора реагентов для идентификации Vibrio cholerae и Vibrio parahaemolyticus методом мультилокусной Real-Time ПЦР в ходе мониторинга объектов окружающей среды / М.В. Полеева, С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, А.В. Алленов, В.П. Борзов, О.С. Чемисова // Клиническая лабораторная диагностика, 2021. Т. 66. N S4 С. 54 - 55.

5. Рыковская О.А. Разработка комплексного метода оценки вирулентности парагемолитических вибрионов / О.А. Рыковская, О.А. Шалу, Е.В. Монахова, Л.М. Смоликова, О.С. Чемисова, Е.Н. Голенищева, Е.М. Санамянц, Г.В. Гальцева // Клиническая лабораторная диагностика. 2013. N 2. С. 38 - 41.

6. Рыковская О.А. Дифференциация представителей Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus / О.А. Рыковская, О.С. Чемисова, Л.М. Смоликова и др.// Клин. лаб. диагностика. 2014. Т. 59. N. 12. С. 50 - 55.

7. Рыковская О.А. Штаммы-продуценты термостабильного прямого гемолизина (TDH) и TDH-родственного гемолизина (TRH) Vibrio parahaemolyticus / О.А. Рыковская, М.В. Полеева, О.С. Чемисова, Е.М. Санамянц // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. Т. 14. N 1. 2018. С. 43 - 48.

8. Смоликова Л.М. Галофильные вибрионы, обусловившие вспышку пищевой токсикоинфекции во Владивостоке / Л.М. Смоликова, Ю.М. Ломов, Т.В. Хоменко, Г.П. Мурначев, Т.А. Кудрякова, О.П. Фецайлова, Е.М. Санамянц, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина, Е.Н. Голенищева. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001. N 6. С. 3 - 7.

9. Baker-Austin С. Vibrio spp. infections / C. Baker-Austin, J.D. Oliver, M. Alam, A. Ali, M.K. Waldor, F. Qadri, J. Martinez-Urtaza // Nat Rev Dis Primers. 2018. Vol. 4. P. 1 - 19.

10. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. The Prokaryotes, Part B: The Gammaproteobacteria / George M. Garrity. 2nd. New York: Springer, 2005. Vol. 2. P. 494 - 546.

11. Bonnin-Jusserand M. Vibrio species involved in seafood-borne outbreaks (Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus): Review of microbiological versus recent molecular detection methods in seafood products / M. Bonnin-Jusserand, S. Copin, C. Le Bris, T. Brauge, M. Gay, A. Brisabois, T. Grard, G. Midelet-Bourdin // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2019. Vol. 59(4). P. 597 - 610.

12. Chonsin K. Characterization of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from clinically asymptomatic seafood workers / K. Chonsin, N. Supha, C. Nakajima, Y. Suzuki, O. Suthienkul // FEMS Microbiol. Lett. 2021. Vol. 368. Issue 1. P. 209 - 214.

13. Haendigenes J. A nonautochthonous US strain of Vibrio parahaemolyticus isolated from Chesapeake Bay oysters caused the outbreak in Maryland in 2010 / J. Haendigenes, J. Jones, R.A. Myers, C.S. Mitchell, E. Butler, M. Toro, N. Gonzalez-Escalona // Appl. Environ. Microbiol. 2016. Vol. 82. N 11. P. 3208 - 3216.

14. Huehn S. Pathogenic vibrios in environmental, seafood and clinical sources in Germany / S. Huehn, C. Eichhorn, S. Urmersbach, J. Breidendenbach, N. Bier, T. Alter, E. Bartelt, C. Frank, B. Oberheitmann, F. Gunzer, N. Brennholt, S. Ber, B. Appel, R. Dieckmann, E. Strauch // Int. J. Med. Microbiol. 2014. Vol. 304(7). P. 843 - 850.

15. Jones E.N. Vibrio infection and surveillance in Maryland, 2002 - 2008 / E.N. Jones, K.A. Feldman, A. Palmer, E. Butler, D. Blythe, C.S. Mitchell // Public Health Rep. 2013. Vol. 128 (6). P. 537 - 545.

16. Li P. MALDI-TOF mass spectrometry-based serotyping of V. parahaemolyticus isolated from the Zhejiang province of China [Электронный ресурс] / P. Li, W. Xin, S. Xia, Y. Luo, Z. Chen, D. Jin, S. Gao, H. Yang, B. Ji, H. Wang, Y. Yan, L. Kang, J. Wang // BMC Microbiology. 2018. Vol. 18:185.

17. Nair G.B. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serovariants / G.B. Nair, T. Ramamurthy, S.K. Bhattacharya, B. Dutta, Y. Takeda, D.A. Sack // Clin. Microbiol. Rev. 2007. Vol. 20. N 1. P. 39 - 48.

18. Nishibuchi M. Thermostable direct hemolysin gene and of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium / M. Nishibuchi, J. B. Kaper // Infect. Immun. 1995. Vol. 63. N 6. P. 2093 - 2099.

19. Park K. S. Cytotoxicity and enterotoxicity of the thermostable direct hemolysin - deletion mutans of Vibrio parahaemolyticus / K. S. Park, T. Ono, M. Rokuda // Microbiol Immunol. 2004. Vol. 48. N 4. P. 313.

20. Schubert S. MALDI-TOF MS in the Microbiology Laboratory: Current Trends / S. Schubert, M. Kostrzewa // Curr. Issues Mol. Biol. 2017. Vol. 23. P. 17 - 20.

21. Yan W. Molecular characterization of clinical and environmental Vibrio parahaemolyticus isolates in Huzhou, China [Электронный ресурс] / W. Yan, L. Ji, D. Xu L. Chen X. Wu // PLoS One. 2020. Vol. 15(10): e0240143. doi: 10.1371/journal.pone.0240143. eCollection 165 2020.