Приложение. Лабораторная диагностика классической чумы свиней

ПРИЛОЖЕНИЕ
к Методическим указаниям
по лабораторной диагностике
классической чумы свиней

1. Материалы и реактивы для постановки реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции.

1.1. Предметные стекла по ГОСТ 9284-75, обезжиренные спирт-эфиром, взятыми в соотношении 1:1.

1.2. Влажная камера (чашка Петри) или стерилизатор с увлажненной фильтровальной бумагой.

1.3. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСК) 0,01 М pH 7,2...7,5 готовят, смешивая:

а) 0,01 М раствор двузамещенного фосфата натрия (1,42 г Na ₂HPO ₄ безводного или 1,78 г N ₂HPO ₄·2H ₂O) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной до 1 дм ³;

б) 0,001 М раствор однозамещенного фосфата калия (1,36 г KH ₂PO ₄) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной до 1 дм ³.

Для приготовления 0,01 М ФСБ с pH 7,2...7,4 смешивают 850 см ³ раствора "а" с 250 см ³ раствора "б".

1.4. Штатив для отмывки препаратов изготавливают из пенопласта размером 10x10x2 см или из деревянной дощечки такого же размера.

1.5. Банка цилиндрическая по ГОСТ 23932-79.

1.6. Нефлуоресцирующий глицерин или глицерин для люминесцентной микроскопии (фирмы "Merck" art. 4095 или любой другой фирмы).

1.7. Парафин по ГОСТ 23683-79.

1.8. Магнитная мешалка любого типа.

1.9. Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней.

2. Поддержание и выращивание перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15).

2.1. Работу проводят в изолированном, стерильном помещении. При одновременной работе с другими линиями клеток принимают меры для предотвращения контаминации одной линии клетками другой.

2.2. Материалы, необходимые для поддержания и культивирования культуры клеток РК-15.

Среда Игла (МЕМ), содержащая L-глутамин (300 мг на 1 дм ³).

Сыворотка фетальная крупного рогатого скота (КРС), не содержащая антител к вирусу диареи крупного рогатого скота.

- 0,25% раствор трипсина;

- 0,02% раствор версена;

- пенициллин, стрептомицин;

- пробирки биологические;

- флаконы (матрасы) РУ;

- покровные стекла 18x18;

- стерильные центрифужные флаконы 100...500 см ³;

- рефрижераторная низкоскоростная центрифуга.

2.3. Культивирование клеток.

2.3.1. Суспензию клеток готовят на среде Игла (МЕМ), содержащей 5...10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, прогретой при (562)°C в течение 30 мин - ростовая среда. Ростовую среду считают пригодной для работы, если монослой формируется на 3...4-е сутки при посадочной концентрации клеток 100 000 в 1 см ³ и объеме суспензии 100 см ³/флакон РУ. Монослой клеток должен представлять собой единый пласт клеток с четким разделением границ между ними. При наличии округлых клеток с вакуолями, включениями и другими признаками цитопатологии данную партию культуры выбраковывают.

2.3.2. Пассаж (пересев) клеток проводят после образования сплошного монослоя клеток. Для этого из матраса удаляют ростовую среду и вносят подогретую до (370,5)°C смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в соотношении 1:9. Матрас помещают в термостат на 5...7 мин. Как только часть клеток начинает отслаиваться от стекла, 90...95% диспергирующего раствора удаляют, добавляют небольшое количество ростовой среды и матрацы энергично встряхивают до полного отделения клеток от стекла и берут пробу суспензии для подсчета клеток. Суспензию клеток разводят ростовой средой до концентрации 100 000 клеток/см ³. К приготовленной суспензии клеток добавляют антибиотики из расчета 100 ЕД/см ³ пенициллина и 100 мг/см ³ стрептомицина и разливают во флаконы РУ по 100 см ³ и по 2 см ³ в пробирки с покровными стеклами. Инкубируют при (370,5)°C. В случае неудовлетворительного роста клеток и формирования монослоя ростовую среду меняют на свежую.

3. Титрование и определение инфекционной активности вируса КЧС. Вируссодержащую культуральную жидкость, разведенную от 10 ^-1 до 10 ^-6 раствором Эрла или Хенкса, вносят в объеме 0,5 см ³ в пробирки с культурой клеток РК-15, выращенной на покровных стеклах, при этом ростовую среду предварительно удаляют. На каждое разведение вируссодержащего материала берут по 4 пробирки с хорошим монослоем.

После 2 ч контакта при (370,5)°C вируссодержащий материал удаляют и вносят по 2 см ³ поддерживающей среды и инкубируют 3 сут при (370,5)°C. Затем пластинки из пробирок извлекают, высушивают, обрабатывают холодным ацетоном. После фиксации ацетон с препаратов удаляют обсушиванием на воздухе (1...2 мин) и ставят РНИФ.

Титром вируса КЧС считают наибольшее его разведение, при котором обнаруживают флуоресцирующие микробляшки или единичные клетки, содержащие специфический цитоплазматический антиген вируса. Вычисляют титр по методу Рида и Менча (или его модификации), выражая его в клеточно-культуральных 50%-ных инфекционных дозах (ККИД ₅₀/объем).

4. Приготовление тест-препаратов для постановки РНИФ.

4.1. Перевиваемую культуру клеток почки поросенка (РК-15), выращенную на покровных пластинках в пробирках, заражают стандартным вирусом КЧС (штамм "Ши-Мынь") в дозе 0,001...0,0001 ККИД ₅₀/клетка в объеме 0,5 см ³ на пробирку, предварительно удалив ростовую среду, и помещают в термостат при (370,5)°C на 2 ч. Затем, удалив вируссодержащую жидкость, вносят поддерживающую среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в условиях термостата при (370,5)°C.

4.2. Через 48 ч инкубации пластинки с зараженной культурой клеток извлекают, укрепляют в расщепы спичек, высушивают, обрабатывают холодным ацетоном в течение 10 мин и хранят в герметически закрытом контейнере при температуре -10...-12°C. Отрицательные тест-препараты готовят аналогично, исключая этап заражения культуры клеток.