Методические указания по микологическому исследованию фузариозного зерна пшеницы (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 20 января 1989 г.)

1. Общее положение

1.1. Фузариозное поражение зерна пшеницы возникает в результате заражения колосьев грибами рода Fusarium в период вегетации растений в условиях повышенной влажности. Возможно интенсивное поражение зерна после уборки - до обмолота (в валках), а также обмолоченного зерна до его просушки.

1.2. При поражении колосьев и зерна в ранней стадии (в период цветения - начала молочной спелости) образуются зерна с более или менее ярко выраженными признаками фузариоза - легковесные, щуплые, морщинистые, с вдавленными заостренными бочками и глубокой бороздкой, с белесой меловидной поверхностью, без блеска, иногда имеют розоватую или малиново-красную окраску; эндосперм рыхлый, крошащийся, ввиду этого в пробе такого зерна много обломков фузариозных зерен. Зародыш темный на срезе, нежизнеспособный. На поверхности зерна можно с помощью лупы, а иногда и невооруженным глазом обнаружить мицелий гриба или скопление конидий (спородохии) - в бороздке зерновки или на зародышевой части.

Зерна, зараженные фузариозом, незадолго до уборки урожая (на стадии восковой спелости и позже) по размерам и форме обычно мало отличаются от здоровых зерен, остальные признаки фузариоза более или менее выражены.

1.2.1. В одной пробе фузариозного зерна, так же как и в одном колосе, можно обнаружить зерна с разной степенью выраженности этого заболевания (имеющие явные его признаки или нечетко проявляющиеся), а также зерна, пораженные фузариями, но практически неотличимые визуально от здоровых. Поэтому микологическим анализом свежеубранного зерна обычно выявляется значительно большее количество пораженных зерен, чем органолептическим.

1.2.2. В отдельных партиях могут наблюдаться зерна пшеницы с розоватой или красноватой окраской, не связанной с заболеванием фузариозом. Зерна при этом, за исключением окраски оболочек, имеют признаки, свойственные нормальному зерну, и подлежат санитарно-микологическому исследованию в обычном порядке.

1.3. Наиболее распространенными возбудителями фузариозов колоса и зерна пшеницы являются в зависимости от зон выращивания F. graminearum, F. ovenaceum, F. culmorum, реже пшеница поражается F. moniliforme, F. oxysporum, F. sporotrichella, F. equiseti. Источники фузариозной инфекции - пораженные грибами растительные остатки в почве и семена, используемые для посева.

1.4. В процессе развития фузариев, иногда еще в период вегетации растений, возможно накопление в зерне токсических метаболитов-микотоксинов; дезоксиниваленола (вомитоксина), зеараленона, Т-2-токсина и др. Попадание этих токсинов вместе с кормом в организм животных приводит к возникновению опасных заболеваний - микотоксикозов.

1.5. В зерне, пораженном фузариозом во время вегетации растений, обмолоченном и просушенном до кондиционной влажности, в процессе длительного хранения происходит постепенное снижение численности фузариев вплоть до полного исчезновения и замены их грибами, свойственными хранящемуся зерну ("плесенями хранения") - видами Aspergillus, Penicillium, мукоровыми грибами. Вторичное увлажнение зерна (при нарушении правил хранения), как правило, приводит к интенсивному развитию "плесеней хранения" - фузарии при этом за небольшим исключением (F. moniliforme) оказываются неконкурентоспособными. Наиболее интенсивный процесс смены микрофлоры происходит в размолотом зерне, отрубях, комбикормах. Контаминация микотоксинами, как правило, сохраняется. Поэтому результаты микологического анализа, в частности на пораженность зерна фузариями, в полной мере отражают состояние лишь свежеубранного зерна.

1.6. Выделение грибов рода Fusarium из зерна, пораженного фузариозом, проводят путем непосредственного посева - раскладывания зерен по поверхности агаризированной среды, в которую для сокращения скорости роста грибов и предотвращения нарастания колоний друг на друга добавляют консервированную медицинскую желчь. Оптимальной средой является модифицированный сусловый агар с желчью. Можно проводить посевы и на агар Чапека с желчью.

2. Отбор проб

2.1. Отбор проб зерна проводят по ГОСТ 13586.3-83.

3. Аппаратура и реактивы

3.1. Для проведения испытания применяют: автоклав, сушильный шкаф, термостат с автоматическим терморегулированием, весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,01 г, ГОСТ 24104-80, бокс для посевов, баню водяную, чашки стеклянные лабораторные типа ЧБН (чашки Петри), ГОСТ 25336-82 или чашки Петри пластмассовые лабораторные однократного применения (ТУ 64-2-19-79), колбы стеклянные вместимостью 500 и 1000 см ³, ГОСТ 25336-82, мензурки или цилиндры мерные вместимостью 500 и 1000 см ³, ГОСТ 1770-74, воронки стеклянные диаметром 100 мм, ГОСТ 25336-82, стаканы химические вместимостью 100 см ³, ареометр Баллинга, горелку газовую или спиртовую, пинцет анатомический, бумагу универсальную индикаторную, бумагу фильтровальную, вату медицинскую гигроскопическую, ГОСТ 5556-81, марлю медицинскую по ГОСТ 9412-77, аммоний азотнокислый, ГОСТ 22867-77, глюкозу по ГОСТ 6038-79, натрий азотнокислый, ГОСТ 4168-79, магний сернокислый, ГОСТ 4528-77, калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, калий хлористый, ГОСТ 4234-77, железо сернокислое закисное, ГОСТ 4148-78, агар-агар, ГОСТ 17206-84, воду дистиллированную, ГОСТ 8763-72, стрептомицин (стрептомицина сульфат), тетрахлорид, сусло пивное неохмеленное, формалин технический, ГОСТ 1625-75, аммиак водный, ГОСТ 3760-79.

4. Подготовка к испытанию

4.1. Для приготовления модифицированного суслового агара неохмеленное пивное сусло, содержащее обычно 12-14% сахаров, фильтруют через тонкий слой ваты или 3-4 слоя марли, разбавляют дистиллированной водой так, чтобы количество сахаров составило 6-7% по ареометру Баллинга, затем добавляют 2-3% агар-агара и 100 мл медицинской консервированной желчи на 1000 мл среды. Разливают среду по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110-112°С и давлении 0,5 МПа в течение 20 мин; рН питательной среды должен быть в пределах 5,5-6,0.

4.2. В состав модифицированного агара Чапека входят следующие компоненты: глюкоза 30,0 г, натрий азотнокислый 2,0, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0, магний сернокислый 0,5, калий хлористый 0,5, железо сернокислое закисное 0,01 г, желчь медицинская 100 мл, вода дистиллированная 1000 мл, агар-агар 20-30 г; рН питательной среды должен быть в пределах 5,5-6,0.

4.3. Для приготовления модифицированного агара Чапека берут 20-30 г агар-агара, заливают его 1000 мл дистиллированной воды и вымачивают 2 ч при комнатной температуре. Воду сливают и измеряют ее объем для определения количества воды, впитавшейся в агар, затем агар промывают 2-3 раза дистиллированной водой.

Отвешивают остальные компоненты среды, кроме желчи, растворяют в таком объеме дистиллированной воды, который составила слитая при вымачивании агар-агара вода. К полученному раствору добавляют отмытый агар-агар, после чего варят среду в автоклаве текучим паром в течение 1 ч. Полученную среду фильтруют, добавляют желчь, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110-112°С и давлении 0,5 МПа в течение 20 мин.

4.4. Перед посевом зерна питательный агар расплавляют в водяной бане, затем после охлаждения его до 45-50°С для подавления сопутствующей бактериальной флоры добавляют антибиотики: 50 мг тетрахлорида и 100 мг стрептомицина на 1000 мл среды. После этого агар разливают в стерильные чашки Петри и дают остыть на ровной горизонтальной поверхности. Слой агара должен быть не менее 0,5 см.

4.5. Фузарии выделяют только из субэпидермальных (глубинных) частей зерна. Для этого перед посевом зерен проводят дезинфекцию их поверхности 3%-ным раствором формалина, для чего зерна, завернутые в марлевую салфетку, размером 10х10 см помещают в баночку или химический стакан вместимостью 100 см ³ и наливают туда дезинфицирующий раствор в таком количестве, чтобы зерна были полностью погружены в него. Через 1 мин дезинфектант сливают, после чего зерно двукратно промывают стерильной водой, к которой предварительно для нейтрализации формалина добавляют 4 мл 5%-ного раствора водного аммиака (раствор готовят на стерильной воде) на 1000 мл воды. Промывную воду сливают, оставляя зерна завернутыми в марлю.

4.6. Для предупреждения загрязнения посевов применяемая посуда должна быть стерильной. Стерилизацию стеклянных чашек Петри, завернутых в бумагу, проводят в сушильном шкафу при температуре 140-160°С в течение 2 ч. Все процессы, связанные с разливкой питательных сред в чашки Петри, дезинфекцией поверхности зерен, а также их посевом, должны проводиться в стерильных условиях - около пламени горелки в специальном боксе.

5. Проведение испытания

5.1. Продезинфицированные зерна раскладывают стерильным анатомическим пинцетом по поверхности агаровой пластинки по 20 шт. в одной чашке Петри таким образом, чтобы они были на возможно равном расстоянии друг от друга, стараясь не перемещать их, чтобы предотвратить появление впоследствии колоний между зернами. Для каждой пробы используют 5 чашек, общее количество посеянных зерен должно быть не менее 100.

5.2. Посевы инкубируют в течение 7 дней в термостате при температуре 22-25°С или в комнате с температурой не ниже указанной. Учет роста Fusarium начинают через 3 сут. На применяемых питательных средах с желчью колонии, как правило, растут более интенсивно, чем другие грибы субпидермальной флоры зерна (Alternaria, Helminthosporium, Epicoccum и др.).

5.3. Дальнейшие микологические исследования - выделение чистых культур Fusarium из первичных посевов, идентификацию их проводят в соответствии с Методическими указаниями по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов, утвержденными 25 февраля 1985 г.