Методические указания по организации микотоксикологического контроля фузариозного зерна и продуктов его переработки фуражного назначения (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 10 октября 1988 г.)

Настоящий документ определяет правила отбора проб пораженного фузариозом зернофуража специалистами государственной ветеринарной службы, порядок пересылки их в ветеринарные лаборатории, порядок подготовки образцов для исследования на содержание микотоксинов трихотеценового ряда, проведения первичных анализов в областных, краевых и республиканских ветеринарных лабораториях и при необходимости арбитражных исследований в специализированных учреждениях.

1. Правила отбора, оформления и доставки проб в лаборатории.

1.1. Обследованию подлежат партии объектов ветеринарно-санитарного надзора растительного происхождения, предназначенные для кормления сельскохозяйственных животных и птиц, прежде всего партии комбикормов, выпускаемых на комбикормовых заводах агропромкомбинатов и кормоцехов колхозов и совхозов*. Первоочередной контроль следует организовать за партиями пшеницы и ячменя, происходящих из регионов, пораженных эпифитотией фузариоза колоса, а также комбикормов, вырабатываемых из такого зерна.

------------------------------

* Ввиду высокой токсичности фузариогенных микотоксинов для свиней в первую очередь рекомендуется обследовать комбикорма типа СК.

------------------------------

1.2. Отбор проб в хозяйствах, их оформление и отправка в лаборатории, обслуживающие зону потребителей, возлагается на ветеринарных специалистов хозяйств, а на комбикормовых заводах - на главных ветеринарных врачей районов, на территории которых находится подконтрольное предприятие.

1.3. Отбор точечных проб и выделение средней пробы следует производить со строгим соблюдением требований ГОСТ 13586.3-83 (пп. 2.2 и 2.5).

1.4. Среднюю пробу массой не менее 2 кг помещают в бумажный пакет или тканевый мешок, вкладывают в него этикетку, отвечающую требованиям ГОСТ 13586.3-83, и надлежащий акт отбора. Упаковку опечатывают печатью ветеринарной службы или хозяйства*.

------------------------------

* Пробы, направляемые для исследования с диагностической целью при подозрении на микотоксикоз, должны сопровождаться подробным описанием клинического течения заболевания и копиями протоколов вскрытия павших или выборочно убитых животных.

------------------------------

1.5. При несоблюдении требований предшествующих пунктов ветеринарные лаборатории имеют право отказать в проведении экспертизы, а результаты экспертизы утрачивают юридическую силу при разборе конфликтных ситуаций.

2. Порядок подготовки проб и первичного исследования в ветеринарных лабораториях.

2.1. Организация подготовки проб фузариозного фуража и первичного исследования их на наличие трихотеценовых микотоксинов возлагается на химико-токсикологические отделы ветеринарных лабораторий, которые должны быть обеспечены оборудованием, материалами, посудой и реактивами, по прилагаемому перечню (приложение 1).

2.2. Поступившую пробу регистрируют в журнале установленной формы с присвоением порядкового номера экспертизы.

2.3. Перед проведением исследования готовят экстракционную смесь, растворы и наполнитель для колонки согласно приложению 2.

2.4. Среднюю пробу зерна или гранулированных комбикормов полностью размалывают на мельнице и лишь после этого в соответствии с требованием п. 2.6 ГОСТ 13586.3-83 выделяют с помощью делителя или методом квадратирования не менее трех отдельных навесок для исследования массой 250,1 г каждая.

Выделение навесок из отрубей, мучки и рассыпных комбикормов допускается без предварительного измельчения, но при тщательном перемешивании всей массы поступившей пробы.

Оставшуюся после выделения навесок пробу ссыпают в маркированный номером экспертизы пакет, опечатывают и хранят в условиях, предотвращающих порчу, не менее одного месяца на случай арбитражного анализа.

2.5. Три навески размолотой средней пробы массой 250,1 г каждая помещают в 3 колбы для экстракции вместимостью 250 мл. Колбы маркируют номером экспертизы.

В каждую колбу мерным цилиндром вместимостью 250 мл отмеряют по 125 мл экстракционной смеси (приложение 2). Колбы закрывают стеклянными пробками, встряхивают 3-4 раза круговыми движениями, не допуская попадания содержимого на горлышко колбы и пробку, и оставляют для экстракции на 16 ч**.

------------------------------

** При необходимости экстракция может быть ускорена помещением колбы на аппарат для встряхивания, обеспечивающий круговое движение в течение 1 ч.

------------------------------

2.6. После окончания экстракции содержимое колб вновь встряхивают круговыми движениями 3-4 раза и фильтруют в конические колбы вместимостью 250 мл через складчатый бумажный фильтр диаметром 15 см, помещенный в стеклянную воронку. По окончании фильтрации колбы закрывают стеклянными пробками и маркируют номером экспертизы. Содержимое колб именуется далее рабочими экстрактами.

2.7. Перед очисткой рабочих экстрактов проводят заполнение колонок и их подготовку к работе, для чего на подложку на дне колонки помещают 5-6 кусочков фильтровальной бумаги, смоченной дистиллированной водой, и уплотняют их стеклянной палочкой. Слой бумаги должен составлять 5-6 мм. С помощью воронки в колонку вносят 1,2 г сорбента К-2 (смесь диатомита марки Порохром с активированным углем) и слегка уплотняют стеклянной палочкой. В верхнюю уширенную часть колонки всыпают 4 г окиси алюминия. Заполненную колонку вставляют в отверстие резиновой пробки и помещают на приемник, представляющий собой пробирку с боковым отводом, закрепленную в лабораторном штативе, или колбу Бунзена вместимостью 250 мл. Отвод пробирки или колбы соединяют с вакуумным шлангом водоструйного или масляного насоса.

2.8. Мерным цилиндром вместимостью 25 мл в колонку вливают 5 мл экстракционной смеси и включают насос. Как только уровень жидкости в колонке опустится на поверхность наполнителя, насос отключают, содержимое приемника сливают и приемник вновь соединяют с колонкой.

2.9. Мерным цилиндром вместимостью 25 мл отмеряют 20 мл рабочего экстракта, вливают 5 мл этого экстракта в колонку и при включенном насосе по мере опускания уровня экстракта порциями вносят в колонку весь отмеренный объем.

2.10. После опускания уровня жидкости в колонке до поверхности наполнителя, не отключая насоса, в колонку тем же мерным цилиндром добавляют 5 мл экстракционной смеси и продолжают отсасывание, пока уровень жидкости вновь не достигнет поверхности наполнителя. Насос отключают, содержимое приемника (элюат) полностью переносят в фарфоровую чашку, маркированную номером экспертизы, и выпаривают элюат досуха при нагревании на песочной бане до 80°С в вытяжном шкафу*.

------------------------------

* При наличии в лаборатории ротационного испарителя процесс удобнее производить с его использованием.

------------------------------

2.11. К сухому остатку в чашке пипеткой вместимостью 1 мл небольшими порциями, тщательно смывая сухой остаток со стенок, приливают 1 мл этилового спирта и этой же пипеткой переносят раствор в маркированную пробирку вместимостью 5 мл. Пробирку помещают на песочную баню, разогретую до 80°С, и концентрируют раствор до объема 0,1-0,2 мл, после чего дают пробирке остыть и доводят объем раствора в ней спиртом точно до 0,5 мл, вращая пробирку для обеспечения полного растворения пленки вещества на ее стенках. Пробирку закупоривают пробкой.

2.12. Процедуру очистки экстрактов** и концентрирования последовательно повторяют для двух оставшихся параллельных экстрактов, каждый раз используя новую колонку и чистую посуду. Содержимое трех пробирок с одинаковыми номерами именуют рабочими растворами***.

------------------------------

** Остатки исходных рабочих экстрактов при необходимости могут быть использованы для анализа на наличие микотоксина зеараленона (Ф-2). Последовательность операций описана в Наставлении по отбору проб зерна, их подготовке к первичному исследованию на содержание микотоксинов, утверждено 21.11.86, N 437-9, п. 2.13, 2.14.

*** При невозможности проведения хроматографических испытаний рабочих растворов в лаборатории по техническим причинам они могут быть выпарены досуха, тщательно укупорены и направлены в специализированное учреждение по согласованию с ГУВ ГАП СССР. При начальном периоде контроля материал вместе с копиями сопроводительных документов направляется во ВНИИ ветеринарной санитарии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, тел. 256-04-50), который производит хроматографические испытания с инструментальной обработкой в соответствии с заключенными договорами.

------------------------------

3. Подготовка к испытанию.

3.1. Подготовка хроматографической камеры, термостата и источника УФ-излучения.

3.1.1. Внутренние стенки камеры обкладывают листами фильтровальной бумаги. Подвижную фазу для хроматографии (п. 8.3) переливают в камеру и закрывают ее крышкой. До начала испытания камеру выдерживают до насыщения парами не менее 30 мин.

3.1.2. Термостат заранее стабилизируют в режиме 92 1°С к моменту начала испытаний.

3.1.3. Источник УФ-излучения должен быть выведен на рабочий режим эмиссии к началу оценки результатов испытания (п. 4.3). Попадание света от посторонних источников освещения, включая дневной свет, на пластинку в момент оценки результатов должно быть исключено полностью.

3.2. Нанесение рабочего и стандартного растворов на пластинку для ТСХ.

3.2.1. Разметка пластинки. Стартовую линию размечают на высоте 20 мм от нижней кромки. Первую точку нанесения на стартовой линии размещают на расстоянии 20 мм от левой кромки пластинки, последующие с интервалом 15 мм друг от друга. Точки номеруют слева направо N 1, 2, ..., 8.

3.2.2. Нанесение рабочего раствора. Раствор наносят с помощью микрошприца МШ-10 (МШ-10М). Из пробирки с 0,5 мл рабочего раствора отбирают объем 2 мкл и наносят его в точку 4. Затем отбирают объем 10 мкл и наносят его в точку 5. Диаметры пятен не должны превышать 3-4 мм. Шприц пятикратно промывают этиловым спиртом.

3.2.3. Нанесение стандартного раствора. Из пикнометра, содержащего стандартный раствор с концентрацией 20 мкг/мл ^-1, чистым шприцем последовательно отбирают объемы 1, 2 и 4 мкл и наносят их в точки 1, 2 и 3 соответственно. Затем отбирают объемы 6, 8 и 10 мкл и наносят их в точки 6, 7 и 8. Диаметры всех пятен должны быть строго одинаковы и не превышать 3-4 мм.

Пластинку выдерживают на воздухе в течение 1-2 мин и приступают к проведению испытания.

4. Проведение испытания.

4.1. Хроматографирование. Пластинку с нанесенными растворами помещают в хроматографическую камеру, насыщенную парами подвижной фазы, и оставляют до момента подъема фронта подвижной фазы на высоту 120 мм от стартовой линии или 10 мм от верхней кромки пластинки (процесс длится около 15 мин) и затем извлекают из камеры.

4.2. Выявление вомитоксина в рабочем растворе и проявление стандарта. Пластинку помещают в вертикальном положении в вытяжном шкафу и с помощью пульверизатора над ее поверхностью равномерно распыляют раствор для импрегнирования до полного смачивания слоя силикагеля. Обработанную таким образом пластинку помещают в термостат и выдерживают при температуре 921°С в течение 15 мин и извлекают для оценки результатов.

4.3. Оценка результатов испытания. Прогретую пластинку сразу же помещают под излучающей поверхностью источника УФ-излучения на расстоянии 20 см от плоскости светофильтра и просматривают в полной темноте на наличие флюоресцирующих пятен на высоте 3-5 см от стартовой линии.

Если над точками N 4 и 5 обнаруживают пятна веществ, идентичных по характеру флюоресценции и подвижности (Rf = 0,3) пятнам вомитоксина над точками N 1-3 и 6-8, делают заключение о наличии вомитоксина в рабочем растворе.

Дискретное определение уровня содержания обнаруженного вещества в пробе используемого продукта проводят в соответствии со следующей таблицей, где знак "=" означает равенство интенсивности флюоресценции пятен.

В случаях, когда количество токсина в пробе превышает концентрацию 12,5 мг/кг ^-1 и имеется необходимость выяснения точного уровня концентрации, испытания повторяют, предварительно разбавив концентрацию оставшегося рабочего раствора этиловым спиртом вдвое, что дает возможность оценить уровни загрязнения до 25 мг/кг ^-1.

5. Протокол испытаний.

Протокол испытаний должен содержать следующие данные:

1) номер экспертизы объекта;

Объем стандартного раствора, мкл		Объем рабочего раствора, мкл		Содержание вомитоксина в зерне, мг/кг -1	Объем рабочего раствора, мкл		Объем стандартного раствора, мкл
1	=		10	0,25
2	=		10	0,50
4	=		10	1,00
				1,25	2	=		1
6	=		10	1,50
8	=		10	2,00
10	=		10	2,50	2	=		2
				5,00	2	=		4
				7,50	2	=		6
				10,00	2	=		8
				12,50	2	=		10

2) наименование объекта и его происхождение;

3) массу партии;

4) дату и место проведения испытания;

5) количество повторностей испытания, результаты параллельных испытаний рабочих растворов и усредненный результат;

6) обозначение настоящей методики;

7) ф.и.о. и должность исполнителя.

6. Выработка рекомендаций по использованию испытуемого объекта.

6.1. При обнаружении токсина в испытуемой пробе в зависимости от установленного уровня загрязнения объекта ветеринарная лаборатория выдает организации, направившей пробу, заключение, содержащее рекомендацию по рациональному использованию неблагополучной партии на фуражные цели в соответствии с Рекомендациями по использованию пораженного фузариозом зерна пшеницы, ячменя, продуктов их переработки - отрубей, мучки, побочных продуктов, лузги и зерноотходов для кормления сельскохозяйственных животных и птицы, утверждены 23.08.88 г.

6.2. Решение вопроса о допустимости использования зерна на продовольственные цели является исключительной прерогативой санитарно-эпидемиологической службы Минздрава СССР.

6.3. При выявлении проб объектов фуражного назначения, имеющих уровни загрязнения токсинов выше 20 мг/кг ^-1, лаборатория обязана информировать вышестоящий отдел ветеринарной службы о наличии выявленной партии.

7. Оборудование, посуда, реактивы и материалы (приложение 1). Мельница зерновая типа МУЛ-1, МРП-1 или эквивалентная. Весы лабораторные технические типа ВЛКТ или эквивалентные с погрешностью взвешивания 0,02 г. Баня песочная, термостатируемая при 80°С. Баня водяная, термостатируемая при 60°С. Насос вакуумный, водоструйный или масляный, обеспечивающий разрежение 10-15 мм рт. ст. с манометром и гибким вакуумным шлангом. Источник УФ-излучения, обеспечивающий выделение излучения в области 366 нм, например ЛПК-1, хроматоскоп ЗМ (ДБ-15, УФС-1) или эквивалентный. Термостат, обеспечивающий нагрев до 100°С с погрешностью 1°С. Камера хроматографическая, стеклянная с герметичной крышкой, имеющая размеры дна 170X60 мм. Пульверизатор для распыления жидкостей, стеклянный. Посуда лабораторная стеклянная, ГОСТ 25336-82 (наименование, тип по ГОСТ, вместимость): колба коническая со стеклянной пробкой Кн-1-1000-29/32 ТС, 1000 мл; колба коническая со стеклянной пробкой, Кн-1-250-24/29 ТС, 250 мл. Воронка лабораторная, В-56-80 ХС, диаметр 56 мм. Пробирка с отводом, П-40-21-150-19/26 ХС, 30 мл. Чашка выпарительная, ЧВК-1-50, 50 мл. Посуда мерная лабораторная стеклянная, ГОСТ 1770-74 (наименование, тип по ГОСТ, вместимость): колба мерная 2-100-2, 100 мл; цилиндр 3-25, 25 мл; цилиндр 1-100, 100 мл; цилиндр 1-250, 250 мл; цилиндр 1-500, 500 мл; цилиндр 1-1000, 1000 мл. Пробирка со стеклянной пробкой П-2-5-14/23 ХС, 5 мл. Колонка хроматографическая стеклянная высотой 65 мм и внутренним диаметром 7 мм с подложкой, имеющая верхний резервуар высотой 110 мм и диаметром 15 мм, или колонка для очистки разового пользования типа КОА-1 (ВНИИВС). Пробирки мерные лабораторные стеклянные (наименование, тип по ГОСТ или ТУ, вместимость): пипетка 4-1-1, ГОСТ 20292-74, 1 мл; пикнометр ПЖЗ-1-2-0,7-КШ, ГОСТ 22524-77, 2 мл; микрошприц МШ-10, ТУ 2.833.106, 10 мкл. Ацетонитрил ч., ТУ 6-09-3534-82. Бензол ч.д.а., ГОСТ 9572-77. Спирт этиловый синтетический технический, ГОСТ 11547-80. Алюминий хлористый ч., ГОСТ 3759-75. Вода дистиллированная. Пластинки для ТСХ "Силуфол" 150X150 мм. Пробирки резиновые N 20 с отверстием диаметром 5 мм для установки колонок с отводом. Бумага фильтровальная. Фильтры бумажные с синей лентой.

8. Приготовление растворов и смесей (приложение 2).

8.1. Раствор 4-дезоксиниваленола (вомитоксина) в метаноле стандартный, концентрация 20 мкг/мл ^-1, в ампулах (ВНИИВС). Порядок использования: вскрыв ампулу, ее содержимое немедленно переносят в пикнометр и закрывают пробкой. Пикнометр маркируют и хранят в холодильнике. Перед нанесением раствора на пластинки для ТСХ пикнометр выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Отбор раствора производят микрошприцем, не допуская изменения концентрации. Воздействие на раствор солнечного света и УФ-излучения не допускается.

8.2. Смесь для экстракции. Порядок приготовления: цилиндром 1-1000 отмеряют 500 мл ацетонитрила. Цилиндром 1-100 отмеряют 100 мл дистиллированной воды, добавляют в ацетонитрил. Смесь переливают в колбу Кн-1-1000-29/32 ТС, тщательно перемешивают и закрывают пробкой.

8.3. Подвижная фаза для хроматографии. Порядок приготовления: цилиндром 1-100 отмеряют 60 мл бензола и переливают в колбу Кн-1-250-24/29 ТС. Этим же цилиндром отмеряют 20 мл этилового спирта и переливают в ту же колбу. Смесь закрывают пробкой и тщательно перемешивают.

8.4. Раствор для импрегнирования силикагеля на пластинках для ТСХ. Порядок приготовления: отвешивают 10 г хлористого алюминия и всыпают его через воронку в мерную колбу 2-100-2. Цилиндром 1-100 отмеряют 80 мл этилового спирта и постепенно добавляют его в колбу с хлористым алюминием, подогревая ее на водяной бане при 60°С. После полного растворения соли раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин, доводят его объем спиртом до метки. Колбу закрывают и маркируют. Перед проведением испытания раствор переносят в пульверизатор.

8.5. Наполнитель для колонок. Сорбент К-2 (выпускается ВНИИВС) или приготовленный следующим образом: в химический стакан вместимостью 100 мл всыпают 70,6 диатомита марки Порохром 1М (0,25-0,315 мм, ТУ 205 Арм. ССР 19-85) и 29,4 г измельченного активированного угля марки АГ-3 и тщательно перемешивают стеклянной палочкой.