Методические указания по определению афлатоксинов (В_1, В_2, G_1, G_2) в кормах для рыб (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 12 сентября 1984 г.)

Методические указания
по определению афлатоксинов (В ₁, В ₂, G ₁, G ₂) в кормах для рыб
(утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 12 сентября 1984 г.)

1. Общие положения. Афлактоксины обладают сильным токсическим и канцерогенным действиями. Наиболее чувствительным видом рыб является радужная форель. Даже незначительные концентрации (0,5-1,0 мкг/кг) афлатоксинов в кормах вызывают образование у радужной форели опухолей печени различной степени злокачественности.

Афлатоксины В ₂, G ₁ и G ₂ встречаются в кормах реже и в меньших концентрациях, чем афлатоксин B ₁, а также уступают ему в токсичности и канцерогенности.

2. Принцип метода. Метод определения афлатоксинов в кормах для рыб основан на очистке пробы, извлечении токсинов, хроматографировании на пластинках "Силуфол" УФ-254 и проведении тестов, подтверждающих наличие афлатоксинов. Чувствительность определения 1,0 мкг/кг. Продолжительность определения афлатоксинов составляет 5 ч.

3. Реактивы, растворы, приборы и посуда. Афлатоксин В ₁ или смесь афлатоксинов B ₁, В ₂, G ₁, G ₂, эфир диэтиловый, гексан, хлороформ медицинский, ацетон, ацетонитрил, бензол, 1 н. раствор серной кислоты, йод кристаллический, силикагель для хроматографии Л 40/100, просеянный через сито N 25, ЧССР, аппарат Сокслета* (объем экстрактора 200 мл), мельница лабораторная, весы технические, ротационный испаритель**, насос водоструйный, прибор для флюоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) или другой источник УФ-света: хроматоскоп и ртутно-кварцевые лампы ПРК-4, СВД-120А, дозатор пипеточный на 10, 50 и 100 мкл, пластинки для тонкослойной хроматографии "Силуфол" УФ-254, цилиндр мерный на 250 мл, колбы плоскодонные конические на 500 мл с НШ 29, колба плоскодонная на 500 мл с НШ 29, колба круглодонная на 500 мл с НШ 29, колба грушевидная на 50 мл с НШ 14, воронки химические диаметром 150 мм, камеры для тонкослойной хроматографии, колонка стеклянная хроматографическая со стеклянным пористым фильтром N 40 размером 50X15 мм, бумага фильтровальная.

4. Ход определения.

4.1. Очистка пробы от липидов. Пробу рыбного корма размалывают, берут навеску 50 г, засыпают в пакет из фильтровальной бумаги, который помещают в аппарат Сокслета. В плоскодонную колбу наливают 200 мл гексана и в нее вставляют аппарат Сокслета с пробой. Колбу подогревают до температуры, позволяющей осуществлять 6-7 циклов сифонизации в 1 ч.

Очистку пробы от липидов проводят до полного осветления гексана в аппарате Сокслета. Затем нагревание прекращают, колбе с раствором липидов дают остыть до комнатной температуры. Раствор сливают в другую колбу и регенерируют гексан на ротационном испарителе для вторичного использования.

4.2. Экстракция афлатоксинов. В плоскодонную колбу с очищенным от липидов образцом наливают 200 мл хлороформа и последовательно совершают операции, указанные в п. 4.1. Полученный таким образом экстракт переливают в круглодонную колбу и на ротационном испарителе освобождают от хлороформа, который может пригодиться для вторичного использования.

Сухой экстракт растворяют в 200 мл ацетона для очистки афлатоксинов от сопутствующих компонентов.

Очистку от липидов и экстракцию можно проводить также на шуттельаппарате.

4.3. Очистка экстракта с помощью колоночной и тонкослойной хроматографии. В колбу с экстрактом добавляют 4 раза по 50 мл ацетона (общий объем 200 мл), каждый раз встряхивая колбу и сливая 50 мл в колонку, заполненную силикагелем. Приемником для колонки служит грушевидная колба на 50 мл. После заполнения колбы ацетон для вторичного использования из нее выпаривают на ротационном испарителе, и колба вновь служит приемником для колонки.

Для дополнительной очистки от жирных веществ стеклянную пластинку размером 200X200 мм (из набора для ТСХ) покрывают незакрепленным слоем силикагеля толщиной 0,5 мм, затем в силикагеле стеклянной палочкой диаметром 2,5 мм делают углубление по всей ширине пластинки на расстоянии 20 мм от ее края. В это углубление наносят конечный объем экстракта и рядом 10-20 мкл стандартного раствора афлатоксина (рис. 1). Пластинку кладут наклонно под углом 10-15 в плоскую хроматографическую камеру с притертой крышкой, заполненную системой растворителей ацетонитрил - ацетон (9:1). Когда линия фронта растворителей достигнет противоположного края пластинки, ее вынимают из камеры и под УФ-светом очерчивают область шириной в 2 см, расположенную на уровне пятна стандартного раствора афлатоксина (пятно с голубой флюоресценцией). После того как силикагель высохнет, очерченную фракцию снимают с помощью водоструйного насоса на фильтр с пористым стеклом (рис. 2). Фильтр промывают несколько раз ацетоном, элюируя фракцию в грушевидную колбу на 50 мл. Ацетон после этого выпаривают на ротационном испарителе для вторичного использования.

Сухой экстракт в грушевидной колбе растворяют в 0,5 мл ацетона.

4.4. Определение количества афлатоксинов хроматографией в тонком слое.

4.4.1. Приготовление стандартных растворов афлатоксинов. Стандартный раствор готовят следующим образом: 2,5 мг кристаллического афлатоксина B ₁ помещают в мерную колбу на 5 мл и доводят до метки смесью растворителей ацетонитрил : бензол (98:2). Полученный раствор афлатоксина В ₁ обозначают как раствор А. Из раствора А берут 0,1 мл и доводят той же смесью растворителей до 5 мл - раствор Б. Из раствора А берут 0,05 мл и доводят смесью растворителей до 5 мл - раствор В. Из раствора В берут 0,5 мл и доводят до 5 мл - раствор Г.

10 мкл раствора Б соответствуют 20 мкг/кг афлатоксина В ₁;

10 мкл раствора В соответствуют 10 мкг/кг;

10 мкл раствора Г соответствуют 1,0 мкг/кг.

Приготовление стандартных растворов афлатоксина B ₂, G ₁ и G ₂ проводят так же, как и в случае афлатоксина В ₁.

Все растворы стандартов хранят в холодильнике в морозильной камере при температуре ниже 0°С. Срок годности раствора А один год, растворов Б, В и Г полгода.

При хранении стандартных растворов свыше указанных сроков концентрации афлатоксинов в них проверяют на спектрофотометре в кварцевой кювете длиной 1 см при длине волны 348 нм по следующей формуле:

,

где С - концентрация афлатоксина, мкг/мл; А - оптическая плотность; Мм - молекулярная масса афлатоксина; K - коэффициент экстинкции.

Например, подставив приведенные ниже значения, получаем для афлатоксина B ₁ : С=15,8·А мкг/мл.

Афлатоксин	Молекулярная масса	Коэффициент экстинкции
В 1	312	19 800
В 2	314	20 900
G 1	328	17 100
G 2	330	18 200

4.4.2. Хроматографирование. Пластинку "Силуфол" УФ-254 размером 15X15 см размечают карандашными линиями, как показано на рисунке 3. На расстоянии 3 см от правого края в нижнем углу наносят ацетоновый экстракт. Пластинку помещают в хроматографическую камеру с растворителями гексан : хлороформ (3:1). Движение фронта растворителей указано на рисунке 3 цифрой 1. Когда линия фронта растворителей достигнет 1,5 см от верхнего края, пластинку вынимают и сушат 5 мин в темноте, затем на нее наносят в указанные на рисунке 3 точки по 10 мкл растворов Г, В, Б. Пластинку, перевернув на 90°, помещают в камеру для ТСХ, но с системой растворителей хлороформ - ацетон (9:1). Когда линия фронта растворителей достигнет 1,5 см от верхнего края, пластинку вынимают и освещают УФ-светом.

4.4.3. Полуколичественное определение и идентификация афлатоксинов. Если под УФ-светом на уровне стандартных пятен обнаружится голубое свечение, то, сравнивая его интенсивность с интенсивностью флюоресценции пятен стандартов, оценивают концентрацию вещества с голубой флюоресценцией в мкг/кг и проводят тесты, подтверждающие наличие афлатоксинов. Для идентификации афлатоксинов необходимо выполнение условий двух тестов:

1-й тест: пластинку с предполагаемыми афлатоксинами осторожно обрабатывают парами йода в течение 20-30 с, помещая ее в камеру, где находится свежеприготовленный раствор йода в эфире. При интенсивной обработке парами йода пластинки чернеют и идентификация становится невозможной. Затем пластинку рассматривают под УФ-светом. Если интенсивность свечения и окраска подозреваемых пятен сохраняется, то пластинку подвергают испытанию вторым тестом;

2-й тест: пластинку опрыскивают 1 н. раствором серной кислоты и рассматривают ее под УФ-светом. Изменение окраски пятен согласно таблице свидетельствует о наличии на пластинке афлатоксинов.

Характеристика афлатоксинов

Афлатоксины	Относительная величина удержания на пластинке для смеси хлороформ - ацетон (9:1)	Окраска под УФ-светом
		без воздействия	в парах йода	в серной кислоте
В 1	0,70	Голубая	Голубая	Зеленая
В 2	0,63	"	"	"
G 1	0,55	Сине-зеленая	Сине-зеленая	Желтая
G 2	0,50	"	"	"

------------------------------

* При отсутствии аппарата Сокслета можно пользоваться аппаратом для встряхивания (шуттель-аппаратом).

* Применяется при отгонке растворителей для повторного использования.