Методические указания по микробиологическому способу выявления комплекса микотоксинов в зерне, отрубях и муке (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 10 декабря 1986 г.)

1. Общие положения.

1.1. Зерно и продукты его переработки могут поражаться токсигенными микроскопическими грибами, токсические метаболиты которых (микотоксины) вызывают острые и хронические отравления животных.

1.2. Метод основан на использовании селекционированных, чувствительных к токсическим метаболитам грибов дрожжевых и бактериальных тест-культур, что позволяет быстро, в течение 24-48 ч, выявлять комплексы микотоксинов, образуемых Fusarium sporotrichiella (T-2-. НТ-2-токсины; диацетоксисцирпенол, ниваленол), Aspergillus fumigatus (койевая кислота, аспергилловая и гельволевая кислоты, глиотоксин, фумигатин), Dendrodochium toxicum, Myrothecuim verrucaria, M. roridum (веррукарин А, роридин А, роридин Н) и Penicillium urticae (патулин*).

------------------------------

* Патулин образуют также некоторые другие виды грибов рода Penicillium, Aspergillus, в частности P. patulinum. P. claviforme, Asp. clavatus и др.

------------------------------

В качестве тест-организмов для определения комплекса микотоксинов, образуемых F. sporotrichiella, используют культуру Saccharomyces fragilis, штамм D-25; D. toxicum и грибами рода Myrothecium - Saccharomyces vini, шт. "Феодосия"; Asp. fumigatus - Staphilococcus aureus, шт. 209; Penicillium urticae, шт. 1749.

Индикаторные тест-культуры высылает Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР (252143, Киев, ул. Заболотного, 26).

Указанные тест-культуры дают зоны задержки роста при наличии микотоксинов в исследуемых образцах кормов. Размер зоны пропорционален содержанию микотоксинов в исследуемых кормах.

1.3. Чувствительность метода для комплекса токсинов, образуемых грибами родов Dendrodochium и Myrothecium, 10-25 мкг/кг, Asp. fumigatus - 10-20 мкг/кг, Fusarium 50-100 мкг/кг, Penicillium и патулинообразующих видов рода Aspergillus - 25 мкг/кг. Микробиологический метод позволяет обнаруживать наличие указанных токсических метаболитов в зерне, отрубях и муке в течение 24-48 ч.

2. Реактивы и оборудование. Хлороформ (для наркоза), спирт этиловый (ректификат), мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА), колбы с притертой пробкой на 500 мл, воронки стеклянные разные, выпарительные чашки разные, пипетки градуированные разные, микропипетки на 0,1 мл, петля микробиологическая, пробирки разные, чашки Петри, мельница лабораторная электрическая, шуттель-аппарат, фильтровальная бумага, диски из фильтровальной бумаги диаметром 5 мм, водяная баня, холодильник шариковый, колбы круглодонные со шлифом, пробки стеклянные со шлифом, термостат, автоклав лабораторный, лампа бактерицидная.

3. Подготовка материалов для исследования.

3.1. Средние образцы кормов отбирают в соответствии с действующими государственными стандартами: зерно фуражное, ГОСТ 13586.3-83; муку и отруби, ГОСТ 9404-88.

3.2. Для анализа из средней пробы отбирают 50 г корма, измельчают на мельнице, помещают в колбу с притертой пробкой и заливают 200 мл хлороформа. Экстрагирование осуществляют на шуттель-аппарате в течение 2 ч.

3.3. Экстракт фильтруют через 2 слоя марли и бумажный фильтр в выпарительную чашку, которую выдерживают под тягой до исчезновения запаха растворителя, после чего в чашку добавляют 2 мл этилового спирта и, перемешивая легкими круговыми движениями, растворяют осадок. Спиртовым раствором, содержащим растворимые метаболиты, пропитывают диски фильтровальной бумаги (по две на каждую индикаторную культуру) и подсушивают их на воздухе.

3.4. Диски готовят из фильтровальной бумаги с помощью канцелярского дырокола и стерилизуют их в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 100-120°С.

3.5. Индикаторные культуры выращивают в бактериологических пробирках в течение 24 ч на следующих средах Sacch. fragilis и Sacch. vini - на скошенном сусло-агаре или среде Ридера при 26°С; Staph. aureus и Е. соli - на скошенном мясо-пептонном агаре при 37°С.

3.6. Выращенные таким образом суточные культуры смывают физиологическим раствором хлорида натрия (3-5 мл) до получения однородной суспензии бактериальных культур с концентрацией 10 ед. по оптическому стандарту мутности, дрожжевых культур - 5 ед.

3.7. Суспензии индикаторных культур вносят по 0,1 мл в пробирки с 10 мл расплавленной и охлажденной до 45°С среды, тщательно перемешивают и выливают в чашки Петри, подогретые до 40-50°С.

4. Выявление микотоксинов в кормах.

4.1. После застывания среды с индикаторными культурами на их поверхность размещают диски, пропитанные экстрактами из различных исследуемых кормов. В качестве контроля используют диск, пропитанный спиртом и подсушенный на воздухе. На одной чашке Петри можно исследовать 4 пробы кормов в двух повторностях (8 дисков).

4.2. Чашки с индикаторными культурами Sacch. fragilis D-25 и Sacch. vini, штамм "Феодосия", выдерживают в термостате при 26°С в течение 18-24 ч, Staph, aureus 209 и Е. coli 1749 при 37°С в течение 12-18 ч. Чашки помещают в термостат дном вверх.

5. Учет и оценка результатов исследования.

5.1. Отсутствие зон задержки роста индикаторных культур свидетельствует о том, что исследуемые образцы кормов не содержат токсических метаболитов грибов Fus. sporotrichiella, D. toxicum, M. verrucaria, M. roridum, Asp. fumigatus, Penicillium urticae и др. патулинообразующих грибов. Такой корм может быть использован для кормления животных.

5.2. Появление зон задержки роста хотя бы одной из индикаторных культур указывает на наличие в исследуемых кормах токсических метаболитов грибов.

5.3. Пробы корма, давшие положительные результаты по микробиологическому методу, исследуют методами, предусмотренными Методическими указаниями по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов от 25.02.85 г. и в зависимости от полученных результатов решают вопрос об использовании корма.