Приложение 2. Инструкция "Основные методы лабораторной диагностики гельминтозов"

Приложение 2

к приказу Минздрава СССР

от 13 августа 1986 г. N 1089

Инструкция
"Основные методы лабораторной диагностики гельминтозов"

Макроскопические методы исследования фекалий

Направлены на поиск гельминтов или их фрагментов (сколексов, члеников и частей стробилы цестод). Применяются для диагностики тех гельминтозов, возбудители которых или не выделяют яйца с экскрементами больного или выделяют их в небольших количествах и не всегда (при энтеробиозе в фекалиях обнаруживаются острицы, при тениидозах - членики цестод); для определения эффективности лечения; при диагностической дегельминтизации (при подозрении на гельминтоз, не обнаруживаемый другими способами).

С целью обнаружения в фекалиях остриц или проглоттид цестод необходимо проводить предварительный просмотр невооруженным глазом фекалий, доставляемых в лабораторию для микроскопических исследований.

Для более точной дифференциальной диагностики тениидозов, определения эффективности лечения и при диагностической дегельминтизации рекомендуется самый простой метод - просмотр разжиженных водой фекалий в черных фотографических кюветах или в чашках Петри на темном фоне.

Обнаружение гельминтов в фекалиях

Принцип - Гельминты или их фрагменты хорошо заметны на темном фоне, их обнаруживают при просматривании разжиженных водой фекалий.

Реактивы - Глицерин (50% раствор).

Специальное оборудование - Лупа, черные фотографические кюветы или чашки Петри, пинцеты, препаровальные иглы.

Ход обнаружения - фекалии размешивают с водой для получения равномерной суспензии, после чего при хорошем освещении тщательно просматривают отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или на темном фоне в чашках Петри. Пинцетом или препаровальной иглой извлекают все подозрительные белые частицы. Крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривают под лупой между двумя предметными стеклами.

Если по клиническим показаниям предполагают обнаружение мелких гельминтов (карликовых цепней и др.) или головок цестод после лечения, то подозрительные частицы рассматривают под лупой в капле глицерина, а в случае необходимости и под микроскопом.

Микроскопические методы исследования
(качественные)

Направлены на выявление яиц и личинок гельминтов. Применяются с диагностической целью, для контроля эффективности лечения, а также для оценки качества проведения комплекса противогельминтозных мероприятий. Для широкого использования в практике лабораторий рекомендуется метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като.

Метод удобен и при проведении массовых обследований. Мазки могут быть приготовлены и доставлены в лабораторию, не занимая большого объема.

При проведении обследования методом Като в очагах гименолепидоза и анкилостомидозов, микроскопию мазков следует осуществлять сразу после их просветления.

Обнаружение яиц гельминтов в фекалиях методом толстого мазка
с целлофановой покровной пластинкой по Като

Принцип - Яйца гельминтов обнаруживают в толстом мазке фекалий, просветленных глицерином и подкрашенных малахитовой зеленью.

Реактивы - 3% водный раствор малахитовой зелени, глицерин, 6% раствор фенола, целлофановые покровные пластинки по Като. Смесь Като: 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени + 500 мл глицерина + 500 мл 6% раствора фенола. Пластинки по Като: гидрофильный целлофан разрезают на пластинки, размером 20 х 40 мм и погружают в смесь Като так, чтобы они прилегали друг к другу (3 - 5 мм раствора Като на 100 пластинок). Через 24 часа они готовы к употреблению. Готовые пластинки можно хранить в растворе Като в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре в течение 6 месяцев.

Ход обнаружения - 100 мг фекалий без добавления воды или какой-либо другой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают вместо покровного стекла целлофановой покровной пластиной, обработанной смесью Като, и придавливают резиновой пробкой так, чтобы фекалии размазались по предметному стеклу в пределах целлофановой пластинки, но не выдавливались из-под ее. Мазок оставляют при комнатной температуре для осветления, после чего просматривают его под микроскопом. Время осветления мазка зависит от температуры воздуха, но даже в прохладном помещении оно не превышает 1 часа; в жаркое время года во избежание пересушивания мазок микроскопируют через 30 - 40 минут. В некоторых случаях, чтобы избежать чрезмерного высыхания препарата, на целлофановую покровную пластинку приготовленного препарата следует класть влажную губку.

Можно использовать пленку, пропитанную только 50% раствором глицерина, эффективность выявления гельминтов при этом не уменьшается.

Методом Като рекомендовано заменить нативный мазок. Для полного выявления всех видов гельминтов толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като обязательно сочетать с методом обогащения.

Обнаружение яиц гельминтов в фекалиях методом обогащения

Принцип - Фекалии суспендируют во флотационном растворе, имеющем больший удельный вес, чем яйца гельминтов (более 1,2). Яйца гельминтов всплывают на поверхность, образовавшуюся пленку исследуют под микроскопом.

Реактивы - Флотационный раствор по Калантарян - 1 кг азотно-кислого натрия растворяют в 1 л воды, смесь кипятят до образования пленки и переливают без фильтрования в сухие бутыли. Удельный вес раствора - 1,38.

Спец. оборудование - Граненые стаканы или склянки с широким горлом, объемом 100 мл, стеклянные палочки.

Ход обнаружения - В стаканах или склянках тщательно размешивают стеклянной палочкой 5 г фекалий, постепенно доливая флотационный раствор до 100 мл. Сразу же по окончании размешивания стеклянной палочкой или бумажным совочком удаляют всплывшие на поверхность крупные частицы. К поверхности солевого раствора прикладывают предметное стекло. Если между смесью и предметным стеклом остается пустое пространство, добавляют солевой раствор до полного соприкосновения смеси с предметным стеклом. Оставляют для отстаивания 20 - 30 минут, после чего предметное стекло осторожно снимают, кладут под микроскоп пленкой кверху и просматривают без покровного стекла всю пленку, прилипшую к поверхности предметного стекла. Во избежание высыхания препарата во время микроскопирования пленку можно смешать с 2 - 3 каплями 50% раствора глицерина.

При отсутствии данной соли можно использовать насыщенный раствор поваренной соли (по Фюллеборну). Для приготовления раствора 400 г. соли растворяют в 1 литре воды, нагревают до кипения, фильтруют через слой ваты или марли и охлаждают. Правильно приготовленный раствор должен иметь небольшой осадок из нерастворяющихся кристалликов соли (уд. вес раствора - 1,2).

В связи с тем, что яйца, имеющие большой удельный вес (неоплодотворенные яйца аскарид, яйца трематод и крупных цестод), не всплывают, помимо исследования поверхностного слоя жидкости при использовании метода Фюллеборна необходимо дополнительно просмотреть 2 - 4 препарата из осадка смеси. Для этой цели (после снятия поверхностной пленки) суспензию осторожно сливают, а из осадка пипеткой или проволочной петлей берут 4 - 8 капель, наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Для просветления препарата можно добавить каплю глицерина.

Специальные лабораторные методы исследования
на различные гельминтозы

Методы исследования на энтеробиоз

Обнаружение яиц остриц в перианальном соскобе
с применением деревянного шпателя

Принцип - Яйца гельминтов, находящиеся в перианальных складках, соскабливают деревянным шпателем (спичкой) и исследуют под микроскопом.

Реактивы - 50% раствор глицерина или 1% раствор двууглекислого натрия (NaHCO3).

Спец. оборудование - Деревянные шпатели (можно использовать отточенную в виде шпателя спичку или спичку с намотанным на нее тонким слоем ваты).

Ход обнаружения - Соскоб с перианальных складок делают утром до дефекации (у женщин и до мочеиспускания) или вечером перед сном. Соскабливания производят осторожно с поверхности перианальных складок деревянным шпателем, смоченным в 50% растворе глицерина или в 1% растворе двууглекислого натрия.

Полученный материал, тщательно счищают со шпателя (спички) краем предметного стекла непосредственно на другое предметное стекло в каплю 50% раствора глицерина и микроскопируют при малом увеличении. Шпатель после однократного использования сжигают.

При обследовании пищевиков, работников общественного питания, удобнее использовать материал из подногтевых пространств, используя смесь из равных количеств 50% водного раствора глицерина и раствора Люголя. В содержимом подногтевых пространств у этих контингентов в большом количестве имеется примесь крахмальных зерен, что затрудняет нахождение яиц остриц. При использовании же раствора Люголя крахмальные зерна окрашиваются в синий цвет, а яйца остриц - в желтый.

Обнаружение яиц остриц в содержимом подногтевых пространств

Принцип - Яйца остриц соскабливают с содержимым подногтевых пространств. При использовании 50% р-ра глицерина и р-ра Люголя желтые яйца гельминтов легко отличимы на бесцветном фоне от синих крахмальных зерен и их обломков.

Реактивы - 50% растворы глицерина и Люголя.

Спец. оборудование - Деревянные шпатели (спички, отточенные в виде шпателя).

Ход обнаружения - Пробу из подногтевых пространств и ногтевого ложа брать спичкой, отточенной в виде шпателя и смоченной в смеси из равных количеств 50% водного раствора глицерина и раствора Люголя и исследовать так же, как и при перианальном соскобе в этой же смеси.

Для диагностики энтеробиоза в последние годы стали использовать бесцветные полиэтиленовые или поливинилхлоридные ленты с липким слоем, применяемые для изоляции и детского технического творчества. Однако токсикологические свойства этой ленты не изучены и использование ее для диагностики энтеробиоза не разрешено. Можно пользоваться лентами, нарезанными из безвредной в токсикологическом отношении липкой операционной пленки (ЛПО-1, ЛПО-2).

Обнаружение яиц остриц в перианальных складках
с использованием липкой ленты

Принцип - Яйца гельминтов приклеиваются к липкой ленте, приложенной к перианальным складкам.

Реактивы - Липкая лента, приготовленная из липкой операционной пленки (ЛПО-1, ЛПО-2).

Спец. оборудование - Пинцеты.

Ход обнаружения - Полоску липкой ленты длиною 10 см и шириной 2 см с помощью пинцета захватывают с одной стороны и наклеивают на перианальную область. Лента должна быть прижата к коже полностью, для чего ее приглаживают металлической или деревянной палочкой. Затем ленту отклеивают и переносят на предметное стекло. Между стеклом и полоской не должно быть пузырьков воздуха. В лаборатории препарат исследуют под микроскопом. Если невозможно просмотреть препарат под микроскопом в тот же день, его можно сохранить в холодильнике.

Методы исследования на тениидозы

Основным методом диагностики тениаринхоза, особенно при массовых обследованиях в очагах, служит опрос на выделение члеников тениид. С целью повышения его диагностической ценности следует проводить опрос с показом члеников бычьего цепня, аскарид и остриц.

Довольно эффективны для диагностики тениаринхоза методы перианального соскоба (см. стр.4) и по Като.

Диагностика тениоза затруднительна в связи с тем, что активного выделения члеников свиного цепня не наблюдается, фекалии в лабораторию доставляются в небольшом количестве и даже эта порция исследуется не полностью. При подозрении на тениоз следует провести диагностическую дегельминтизацию (малыми дозами папоротника, семенами тыквы).

Методы исследования на стронгилоидоз

Диагноз стронгилоидоза ставится при нахождении в фекалиях не яиц, а личинок гельминта. Обычные методы гельминтоовоскопии в связи с особенностями биологии паразита при исследовании на стронгилоидоз неприемлемы. Необходимо использование специальных методов, выявляющих личинки гельминтов. Наиболее эффективным методом выявления личинок паразитов является классический метод Бермана, основанный на их положительном термотаксисе.

Обнаружение личинок гельминтов в фекалиях по Берману

Принцип - Метод основан на способности личинок мигрировать к теплу.

Реактивы - Не требуются.

Спец. оборудование - Металлический штатив, сетка, зажимы, воронки, резиновые трубки, центрифуга.

Ход обнаружения - На узкий конец стеклянной воронки надевают резиновую трубку с зажимом и укрепляют ее на металлическом штативе. В воронку помещают металлическую сетку, на которой находится 5 - 10 грамм фекалий. Приподняв сетку, заполняют воронку подогретой до 40 - 45° С водой так, чтобы нижняя часть сетки с фекалиями была погружена в воду. Личинки из фекалий активно переходят в теплую воду и скапливаются в нижней части резиновой трубки, надетой на воронку. Через 4 часа зажим на трубке открывают и спускают жидкость в 1 - 2 центрифужные пробирки. После центрифугирования в течение 2 - 3 минут надосадочную жидкость быстро сливают, а осадок переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом.

При проведении массовых обследований на стронгилоидоз в эндемичных очагах можно использовать метод Брумпта в модификациях.

Упрощенный метод выявления личинок стронгилоидес
в фекалиях при массовых обследованиях

Принцип - Тот же.

Реактивы - Не требуются.

Спец. оборудование - Стеклянные или парафинированные стаканчики, чашки Петри.

Ход обнаружения - Фекалии собирают в стаканчики и заливают 10 - 15 мл обычной (водопроводной) воды комнатной температуры. Через 20 минут воду сливают в чашку Петри и исследуют под микроскопом.

При клинических показаниях на стронгилоидоз, в случаях ненахождения личинок в фекалиях методом Бермана, рекомендуется исследования дуоденального содержимого и желчи. Исследование дуоденального содержимого и желчи можно проводить также при подозрении на гельминтозы с локализацией возбудителя в печени, желчном пузыре, двенадцатиперстной кишке (описторхоз, фасциолез, клонорхоз, дикроцелиоз, трихостронгилидозы.

Обнаружение яиц и личинок гельминтов
в дуоденальном содержимом и желчи

Принцип - Яйца и личинки гельминтов, паразитирующих в печени, желчном пузыре, поджелудочной железе или 12-перстной кишке, могут быть обнаружены в желчи и дуоденальном содержимом, полученном при дуоденальном зондировании.

Реактивы - Серный эфир.

Спец. оборудование - химические стаканы или склянки, покровные стекла или целлофановые пластинки по Като, центрифуга.

Ход обнаружения - Дуоденальное содержимое и желчь (порции А, В, С) получают обычным путем при помощи зондирования. При получении порции "В" необходимо получить рефлекс желчного пузыря введением через зонд 33% раствора сернокислой магнезии.

Из исследуемой жидкости сначала выбирают и просматривают под микроскопом плавающие в ней хлопья, а затем смешивают ее с равным количеством серного эфира. Смесь тщательно взбалтывают и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а весь осадок исследуют под микроскопом.

Методы исследования на анкилостомидозы

В очагах анкилостомидозов для диагностики этих болезней применяется метод обогащения по Фюллеборну, но можно использовать и метод обогащения по Калантарян.

В остаточных очагах анкилостомидозов и в клинических условиях для дифференциальной диагностики между анкилостомозом и некаторозом рекомендуется метод культивирования личинок.

Обнаружение личинок гельминтов в фекалиях культивированием
их на фильтровальной бумаге (метод Харада и Мори в модификациях)

Принцип - В тепле на влажной фильтровальной бумаге из яиц анкилостом или некатора, выделенных с фекалиями, развиваются филяриевидные личинки, которые могут быть легко обнаружены.

Реактивы - Не требуются.

Спец. оборудование - Лупа, термостат на 28° С.

Ход обнаружения - На фильтровальную бумагу размером 16 х 3,5 наносят тонким слоем фекалии таким образом, чтобы края бумаги оставались свободными. Бумагу с фекалиями помещают в банку объемом 0,8 л, заполненную водой так, чтобы нижний край бумаги, свободный от фекалий, был погружен в воду. Банку на 5 - 6 дней помещают в термостат при 28° С. Филяриевидные личинки, развившиеся из яиц за это время, спускаются по фильтровальной бумаге и оседают на дне банки. По окончании инкубации фильтровальную бумагу извлекают из банки и уничтожают, а жидкость исследуют под лупой. В сомнительных случаях жидкость центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом. (Работать только в резиновых перчатках!).

Примечание: в теплое время года можно оставлять пробирки при комнатной температуре, но время инкубации увеличивается при это до 8 - 10 дней.

Метод исследования на легочные гельминтозы

При подозрении на гельминтозы, возбудители которых паразитируют в легких (парагонимус) или в трахее (Thominx aerofilus) необходимо исследовать мокроту.

Обнаружение яиц и отдельных гельминтов в мокроте

Принцип - Яйца гельминтов обнаруживаются в тонком слое мокроты.

Реактивы - 0,5% раствор едкого калия или натрия.

Спец. оборудование - Центрифуга, колбочки, водяная баня, стеклянные пластинки.

Ход обнаружения - Мокроту размазывают на стеклянной пластинке (или предметном стекле), плотно прикрывают другой пластинкой и рассматривают сначала невооруженным глазом на светлом или черном фоне, а затем под микроскопом. Частицы мокроты ("ржавые" скопления, обрывки тканей и др.) исследуют отдельно под покровным стеклом при малом и большом увеличении микроскопа.

Гнойную мокроту смешивают в колбочке с равным количеством 0,5% раствора едкого калия или натрия, встряхивают в течение 3 - 5 минут, слегка нагревают на водяной бане, центрифугируют в течение 3 - 5 минут при 1500 об./мин. и исследуют осадок под микроскопом.

Методы исследования на фасциолез

Обнаружение яиц гельминтов в фекалиях методом
последовательных промываний

Принцип - Обнаружение крупных яиц фасциол в отмытом осадке фекалий.

Реактивы - Не используются.

Спец. оборудование - Чашки Петри.

Ход обнаружения - Небольшую порцию фекалий смешивают с водой в чашке Петри и оставляют на несколько минут до осаждения взвешенных частиц. Надосадочный слой сливают и заменяют чистой водой. Процедуру повторяют несколько раз до получения прозрачной надосадочной жидкости, отмытый осадок исследуют под микроскопом. Для исследования используют несколько проб фекалий.

Методы обследования на шистосомозы

Исследование мочи.

Принцип - Яйца и отдельные фрагменты гельминтов обнаруживаются в осадке мочи.

Реактивы - Раствор Люголя или 1-2% водный раствор метиленового синего, 50% раствор глицерина.

Спец. оборудование - Центрифуга, пробирки центрифужные.

Ход обнаружения - Мочу обследуемого в объеме не менее 50 мл, собранную в середине дня, помещают в конический стакан и дают отстояться в течение 30 минут. Отстоявшуюся мочу сливают. Пипеткой наносят на предметное стекло каплю из осадка мочи, приготовляют мазок и исследуют под малым увеличением микроскопа. Добавление к осадку 1 - 2 капель 50% раствора глицерина значительно просветляет осадок и облегчает его исследование.

Можно использовать центрифугирование (особенно при низкой интенсивности инвазии).

Пробу свежей мочи помещают в 2 центрифужные пробирки по 10 мл и центрифугируют при 1000 - 1500 обор./мин. в течение 5 - 10 минут. Из осадка готовят препараты и исследуют под малым увеличением микроскопа. К препаратам можно добавлять 1 - 2 капли красителя (раствор Люголя или 1 - 2% водного раствора метиленового синего). Это создает цветной фон, что облегчает выявление яиц шистосом.

Исследование фекалий

Метод осаждения фекалий (простой)

Принцип - В осадке хорошо просматриваются яйца шистосом, отделенные от разнообразных органических элементов, содержащихся в фекалиях.

Реактивы - Растворитель из водного раствора 50% глицерина и изотонического раствора хлорида натрия в соотношения 1 : 1.

Ход обнаружения - В коническом стакане емкостью 200 мл смешивают 1 г фекалий с 1 - 2 мл растворителя. Разводят содержимое с растворителем до объема сосуда и дают отстояться в течение 20 - 30 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок исследуют под малым увеличением микроскопа на наличие яиц. Для получения лучшей концентрации осадок нужно ресуспендировать в растворителе до получения взвеси и дать ей отстояться в коническом стакане в течение 10 минут. Осадок с придонного слоя забирают пастеровской пипеткой, помещают 2 капли на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.

Метод осаждения фекалий по Ритчи

Принцип - Яйца шистосом обнаруживаются в осадке, полученном после центрифугирования.

Реактивы - Изотонический раствор хлорида натрия, 10% раствор формалина, эфир.

Спец. оборудование - Сосуд вместимостью 150 мл, воронка на 50 мл, центрифуга, центрифужные пробирки и пробки для них, аппликаторы, пипетки с резиновой грушей.

Ход исследования - В сосуде смешивают, примерно, 2 г фекалий с 10 мл изотонического раствора хлорида натрия и помещают в центрифужную пробирку, вместимостью 15 мл. Пробирку закрывают пробкой и встряхивают в течение 30 секунд. Пробку удаляют, а содержимое центрифугируют в течение 2 минут при 2000 обор./мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, добавляют к осадку 10 мл 10% раствора формалина, тщательно смешивают и дают смеси отстояться 5 минут. Добавляют в нее 3 - 4 мл эфира, закрывают пробирку пробкой, встряхивают для получения однородной смеси, удаляют пробку и центрифугируют повторно в течение 2 минут. В результате центрифугирования в пробирке образуется 4 слоя: 1) осадок на дне пробирки с яйцами шистосом, 2) слой формалина, 3) слой фекального детрита (волокна, жир и т.д.), 4) слой эфира. Аппликатором удаляют детрит, сливают надосадочную смесь формалина с эфиром, осадок с придонного слоя забирают пастеровской пипеткой и исследуют под малым увеличением микроскопа.

Количественные методы диагностики гельминтозов

При необходимости установить интенсивность инвазии применяют количественные методы исследований. Эти методы позволяют судить о качестве дегельминтизации, давать оценку эффективности различных антигельминтных препаратов, а также могут служить контролем проводимых массовых лечебно-профилактических мероприятий. Из количественных методов исследований фекалий в СССР до последних лет наиболее широко применялся метод Столла. Однако, следует учитывать, что при малоинтенсивных инвазиях он мало чувствителен.

Метод консервирования фекалий

Фекалии для исследования всеми вышеуказанными методами должны доставляться в лабораторию свежими (не более суточной давности). В случаях необходимости длительного хранения материала, а также с целью исключения влияния неблагоприятных условий при транспортировке, которые могут привести к деформированию яиц гельминтов, рекомендуется консервация фекалий жидкостью Барбагалло или растворами синтетических детергентов (моющих средств типа "Лотос", "Экстра" и др.). Соотношение фекалий и раствора должно быть 1 : 10.

Работа с фекалиями в лаборатории

Фекалии желательно собирать в стеклянную или пластмассовую посуду, парафиновые стаканчики, на которые наклеивают этикетку с указанием фамилии, имени, отчества, возраста и адреса обследуемого.

Фекалии следует доставлять в количестве не менее 1/4 стакана, так как небольшие порции испражнений быстро высыхают и яйца в них деформируются. Кроме того, иногда возникает необходимость в повторном исследовании другими методами. Фекалии, направленные в лабораторию, должны исследоваться в день доставки, а при невозможности этого их нужно хранить в холодном месте до следующего утра.

После проведения анализов посуду следует дезинфицировать кипячением или выдерживанием в течение 5 часов в 5% растворах фенола, лизола, 2% раствора крезола.

В случае необходимости хранения материалов в течение нескольких дней следует применять консерванты.

При регистрации результатов анализа названия гельминтов обозначают по современной номенклатуре (латинское название).

При всех методах лабораторной диагностики гельминтозов необходимы: микроскоп (обычный биологический - МБИ разных систем), предметные стекла, покровные стекла.

Просмотр препаратов начинают под малым увеличением с окуляром 7; 10, в сомнительных случаях пользуются большим увеличением микроскопа. Для обнаружения личинок S.stercoralis, А.duodenale, N.americanus могут быть использованы бинокулярные стереоскопические микроскопы (МБС).

В лабораториях необходимо следить за исправностью работы вентиляции вытяжных шкафов.