Приложение 1. Методы определения токсичности

1.1. Метод определения острой токсичности

Животные: мыши массой не более 20 г; крысы массой от 140 до 160 г; морские свинки массой от 250 до 350 г; кролики массой от 2,0 до 2,5 кг, животные других видов. Формирование групп животных, получающих разные дозы испытуемого препарата и препарата сравнения, проводят методом случайной выборки (единица выборки - животное).

При внутривенной инъекции объем вводимого препарата на 1 кг массы животного не должен превышать: для мышей - 25 мл, для крыс и морских свиней - 15 мл, для кроликов - 10 мл. Максимальные объемы должны вводиться мышам в течение 5 сек, крысам и морским свинкам - в течение 10 сек, кроликам - в течение 20 сек.

За животными наблюдают не менее 7 сут. после введения препарата.

Величину ЛД50 рассчитывают по результатам наблюдений через 30 мин, 24 ч и через 7 сут. и выражают в массовых, объемных или других единицах на 1 кг массы животного.

Материал для проведения гистологического исследования забирают от животных, которым испытуемый препарат был введен внутривенно, а также методом, предлагаемым для практики, в максимально переносимой дозе (МПД), не вызывающей гибели животных. Допускается проведение гистологического исследования органов одного вида животных, оказавшегося более чувствительным к токсическому воздействию препарата, и использование одной серии препарата, ЛД50 которой была наименьшей. Взятие материала осуществляют через 24 ч, 4 сут. и 7 сут. не менее чем от 5 животных на каждый срок, а также от всех животных, павших в течение наблюдения (см. п.5.2.4).

1.2. Метод определения хронической токсичности

Животные: см. "Определение острой токсичности ".

Препарат вводят не менее, чем 20 животным один раз в сутки в оптимальной иммунизирующей (эффективной) дозе для данного вида животного или в дозе, эквивалентной предлагаемой для человека, при пересчете на 1 кг массы или площадь поверхности тела. Если препарат в течение 1 мес. предполагается применять человеку от 1 до 3-х раз, количество однократных ежедневных инъекций должно быть не менее 10, а более 3-х - не менее 20; перерыв в курсе введения не допускается.

Наблюдение за животными проводят в течение периода введения препарата и последующих 7 сут. При этом ежедневно регистрируют массу животных, а также возможные клинические симптомы интоксикации. Не менее 5 животных забивают на следующие сутки после последнего введения препарата и не менее 5 в день окончания наблюдения, и их органы подвергают гистологическому исследованию (см. п 5.2.4).

Гистологическому исследованию подвергают также органы всех животных, павших в течение периода наблюдения.

1.3. Метод определения влияния на детоксицирующую функцию печени

Испытание проводят на беспородных белых мышах массой 18-20 г. Необходимо учитывать, что в условиях одного опыта колебания массы животных не должны превышать 1 г, в противном случае могут быть получены некорректные результаты.

Испытуемый препарат и препарат сравнения вводят внутрибрюшинно в дозе, которую предполагают использовать (используют) человеку; препараты, предназначенные для энтерального введения, вводят через рот.

Количество животных в каждой группе должно быть не менее 25. Раствор гексенала на дистиллированной воде вводят внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл из расчета 80-90 мг/кг массы животного (в зависимости от чувствительности животных, сезона и т.п.) через 48-72 ч после введения препарата.

Перед началом исследования рекомендуется оттитровать рабочую дозу гексенала, которая должна вызвать у интактных мышей наркоз продолжительностью от 30 до 40 мин. Необходимо учитывать, что животные должны находиться на полноценном пищевом режиме, т.к. голодание может увеличить продолжительность наркоза. Поскольку во время наркоза температура тела животных снижается, температура в помещении должна быть не менее 20°С.

Время введения гексенала каждому животному регистрируют с помощью секундомера. Для удобства работы можно вводить препарат небольшим группам (до 5) животных, фиксируя по секундомеру время введения препарата каждой группе.

Заснувших мышей раскладывают на столе на боку. Регистрируют время пробуждения каждого животного (проснувшимися считают мышей, вышедших из бокового положения) и определяют продолжительность наркоза. За продолжительность наркоза условно принимают время от момента введения гексенала до момента пробуждения.

Длительность гексеналового наркоза для группы животных (контрольной, получившей испытуемый препарат, препарат сравнения) рассчитывают с помощью средней арифметической или медианы. Расчет медианы имеет определенные преимущества, если в группах имеются длительно непросыпающиеся животные.

1.4. Метод определения токсичности препаратов бактериофага

Данные исследования проводят на белых мышах массой 18-20 г, в каждой группе - не менее 20. Необходимость проведения гистологических исследований зависит от биологических свойств бактерий, их способности к образованию эндотоксинов.

Определение острой токсичности предполагает однократное внутрибрюшинное введение фага в дозе, многократно превышающей максимальную разовую для человека в пересчете на единицу массы тела (100-200 раз). Животные не должны терять в весе, должны отсутствовать признаки заболевания и в месте введения препарата - инфильтраты. При исследовании периферической крови опытных животных после введения бактериофага не должны обнаруживаться значительные изменения в содержании лейкоцитов по сравнению с контрольной группой.

Определение хронической токсичности предполагает ежедневное внутрибрюшинное введение фага в течение 20 дней в дозе, эквивалентной максимально разовой дозе для человека в пересчете на единицу массы тела.

Наблюдения за животными проводят в течение всего периода введения и последующих 7 сут. с ежедневной регистрацией массы тела животных, а также возможных клинических проявлений интоксикации.

Определение местного действия бактериофага осуществляется в случае использования препаратов внутримышечно в дозе, предлагаемой для применения. Оценку проводят на основании данных осмотра на протяжении всего срока введения препарата и последующих 7 сут.

1.5. Метод определения токсичности аллергенов

Данное исследование осуществляется на двух видах животных: белых мышах - по 0,5 мл внутрибрюшинно, морских свинках - по 1 мл подкожно. В тех случаях, когда аллергены предназначаются для специфической иммунотерапии, что сопряжено с многократным их введением, оценку токсичности проводят с равным количеством подкожных инъекций морским свинкам (или кроликам) в дозах, рекомендуемых для практического применения.

2.1. Проба с ТСК

Раствор ТСК на дистиллированной воде вводят внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. Перед началом исследования определяют дозу препарата, которая должна вызвать у интактных мышей развитие судорожных приступов и последующую гибель почти всех животных (ЛД95). При этом первый судорожный приступ должен развиться через (40+-5 мин), а гибель основного числа животных должна наступить через 70-90 мин. Как правило, эта доза находится в пределах от 18 до 25 мг/кг массы.

Регистрацию времени введения ТСК каждому животному, времени развития судорог и гибели осуществляют с помощью секундомера. За животным наблюдают в течение 3 ч.

Определяют среднюю длительность жизни мышей опытной и контрольной групп и достоверность различий между показателями.

2.2. Коразоловая проба

Раствор коразола на дистиллированной воде вводят подкожно в объеме 0,2 мл. Перед началом исследования определяют дозу препарата, которая должна вызывать у интактных мышей развитие судорог и последующую гибель почти всех животных. Как правило, эта доза находится в пределах от 90 до 100 мг/кг массы.

В отличие от пробы с ТСК при использовании коразола приступы судорог развиваются уже в первые минуты после введения препарата, а гибель основного числа животных наступает в течение 30 мин.

Регистрацию времени введения коразола, развития судорог и гибели животных проводят так же, как после введения ТСК. За животными наблюдают в течение 60 мин. Определяют среднюю длительность жизни мышей опытной и контрольной групп и достоверность различий между показателями.

3.1. Методика орального введения белым мышам, морским свинкам, кроликам и обезьянам орального таблетированного МИБП

Принцип метода состоит в обеспечении контакта МИБП со слизистой ротовой полости в течение 2-3 мин.

Нарезают губку или другой пористый материал кусочками объемом: для белых мышей - 0,3-0,5 см3, морских свинок и кроликов - 0,5-1,0 см3, обезьян - 1-2 см3.

Таблетку измельчают и растворяют в таком количестве дистиллированной воды, чтобы 1 доза препарата для белой мыши или морской свинки содержалась в 0,5 мл, а для кролика - в 1 мл суспензии. Полученную суспензию сорбируют губкой, фиксированной в кровоостанавливающем зажиме. Мышей и морских свинок фиксируют в руке. Кроликов помещают в ящик для иммобилизации. Обезьян фиксируют за шею руками. Затем вводят губку в ротовую полость животного и удерживают ее в течение 2-3 мин. Все манипуляции выполняют осторожно, чтобы не повредить слизистую ротовой полости.

3.2. Методика энтерального введения кроликам и обезьянам жидкой формы МИБП

Принцип метода состоит во введении жидкого препарата на неповрежденную слизистую с помощью трубки, проведенной через верхние отделы желудочно-кишечного тракта в двенадцатиперстную кишку.

У кроликов и обезьян натощак удаляют волосяной покров на участке, расположенном ниже мечевидного отростка по срединной линии живота, размером 5х15 см. У обезьян эту процедуру проводят после достижения полного наркоза.

Кроликов фиксируют на операционной доске животом вверх и наркотизируют до исчезновения болевой чувствительности. Обезьян фиксируют на операционной доске после проведения наркоза. Подготовленное операционное поле обрабатывают 3%-ным спиртовым раствором йода и ограничивают его стерильными салфетками с помощью корнцангов. После проведения верхнесрединной лапаротомии через разрез извлекают из брюшной полости желудок с прилежащим участком двенадцатиперстной кишки. Затем через рот, пищевод и желудок вводят в двенадцатиперстную кишку на глубину 2-4 см газоотводную трубку, которую фиксируют пальцами в области перехода из желудка в кишечник. Все манипуляции выполняют через стенку желудка. После этого другой лаборант через трубку при помощи шприца вводит 1-2 мл жидкой вакцины с последующим промыванием трубки физиологическим раствором объемом 20-30 мл. Желудок и кишечник помещают в брюшную полость и вводят в нее 2 мл раствора антибиотиков (100-200 тыс.ед/мл). Операционную рану послойно зашивают. Все манипуляции выполняют с помощью стерильных инструментов и материалов с соблюдением правил асептики и антисептики.

Первое кормление животных допускается на следующий день после операции. Продолжительность наблюдения за животными - до 30 сут. (в зависимости от цели исследования). Отход животных во время операции и в период наблюдения составляет не более 5% и обусловлен оперативным вмешательством.

3.3. Методика энтерального введения кроликам и обезьянам энтерального таблетированного МИБП

Принцип метода состоит в пероральном введении энтерального таблетированного препарата в желудок с помощью эзофагатора и принудительной эвакуации его из желудка в кишечник.

Подготовку животных проводят так же, как при энтеральном введении жидкой формы МИБП.

Кроликов помещают в ящик для иммобилизации и с помощью эзофагатора проталкивают энтеральный таблетированный препарат в глотку, исключая повреждение защитной кишечно-растворимой оболочки во рту.

С обезьянами эту манипуляцию выполняют 2 сотрудника. Один фиксирует животное за шею. Второй с помощью эзофагатора вводит через рот в глотку энтеральную таблетку, исключая повреждение зубами животного защитной кишечнорастворимой оболочки.

Энтеральный таблетированный препарат вводят с таким расчетом, чтобы срок пребывания таблетки в желудке не превышал 2 ч. При раздражении слизистой глотки таблеткой срабатывает безусловный глоточный рефлекс, и животное глотает таблетку, которая при этом попадает в желудок.

Животных наркотизируют, привязывают к операционной доске, обрабатывают операционное поле 3%-ным спиртовым раствором йода и ограничивают его стерильными салфетками с помощью корнцангов. После проведения верхнесрединной лапаротомии через разрез извлекают из брюшной полости желудок с прилегающим участком кишечника и, нащупав таблетку в желудке, проталкивают ее в кишечник. Желудок и кишечник погружают в брюшную полость и вводят в нее 2 мл раствора антибиотиков (100-200 тыс.ед/мл). Операционную рану послойно зашивают. Все манипуляции выполняют с помощью стерильных инструментов и материалов с соблюдением правил асептики и антисептики.

Первое кормление животных допускается на следующий день после операции. Продолжительность наблюдения за животными - до 30 сут. (в зависимости от цели исследования). Отход животных во время операции и в период наблюдения составляет не более 5% и обусловлен оперативным вмешательством.

Возможности использования различных лабораторных животных для перорального введения суммированы в таблице.

Таблица

Возможность использования различных лабораторных животных для перорального введения

+---------------------------------+-----+-----+-------+-------+---------+

|Методика введения                |Белые|Белые|Морские|Кролики|Обезьяны |

|                                 |мыши |крысы|свинки |       |         |

+---------------------------------+-----+-----+-------+-------+---------+

|1. Оральное введение губкой      |  +  |  +  |   +   |   +   |    +    |

|препарата в жидком виде          |     |     |       |       |         |

+---------------------------------+-----+-----+-------+-------+---------+

|2. Пероральное (энтеральное)     |  +  |  +  |   +   |   +   |   ++    |

|введение препарата, устойчивого  |     |     |       |   -   |         |

|к кислой среде желудка           |     |     |       |       |         |

+---------------------------------+-----+-----+-------+-------+---------+

|3. Пероральное введение:         |     |     |       |       |         |

|                                 |     |     |       |       |         |

|таблетки с защитным энтеросолю-  |  -  |  -  |   -   |   -   |   ++    |

|бильным покрытием (диаметром     |     |     |       |       |         |

|4-9 мм)                          |     |     |       |       |         |

|                                 |     |     |       |       |         |

|экспериментальных форм (таблет-  |  -  |  +  |   +   |   +   |   ++    |

|ки диаметром 2-3 мм, гранулы)    |     |     |       |       |         |

|с энтеросолюбильным защитным     |     |     |       |       |         |

|покрытием                        |     |     |       |       |         |

+---------------------------------+-----+-----+-------+-------+---------+

|4. Оперативное введение в        |  -  |  -  |   +   |   +   |    +    |

|тонкую кишку (введение зонда)    |     |     |   -   |       |         |

+---------------------------------+-----+-----+-------+-------+---------+

|Примечания. Степень пригодности для оценки свойств МИБП:               |

|++ наиболее полная                                                     |

|+ достаточная                                                          |

|+ сомнительная                                                         |

|-                                                                      |

|- непригодна или невозможна.                                           |

+-----------------------------------------------------------------------+