Методические указания МУК 4.2.1004-00 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) B 99 - продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 декабря 2000 г.)

4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы

Методические указания МУК 4.2.1004-00
Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) B 99 - продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 декабря 2000 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТов 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначенные для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

2. Характеристика штамма-продуцента витамина В12

Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 является продуцентом витамина В12. Штамм растет на агаризованных средах на основе мелассы при температуре 28°С. В течение 3-х суток образует округлые колонии 1-2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45-0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл/м3.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В12 на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 Лупа с увеличением х 10 Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл Секундомер Барометр Марля медицинская Вата медицинская гигроскопическая

ТУ 64-12791-77 ГОСТ 9586-75 ГОСТ 25706-83 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 1770-74 ГОСТ 1770-74 ГОСТ 9586-75 ГОСТ 246 96-79 ГОСТ 9412-77 ГОСТ 25556-81

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10515-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: левомицитин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента

Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH4)2 HPO4 - 1,3 г; MgSO4 7H2O - 1,0 г; (NH4)2SO4 - 0,5 г; MnSO4H2O - 0,1 г; ZnSO4 7H2O - 0,1 г; агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 - 7,0; стерилизация 121°С, 30 мин.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +- 5°С), атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента витамина В12 воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5-20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2-3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60°С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицитин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28°С. Через 48-72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:

                               N x 1000

                          Х = --------- , кл/м3, где

                                  V

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода применяют следующий расчет концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 см2.

Составляем пропорцию:

на 100 см2 за 1 мин оседает 2 л воздуха

на 78,54 см2 - Х л

Х = 1,57 л/мин,

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 м3 воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57 х Т л.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м3 воздуха содержится -

                            N х 1000   N х 636,9

                          ---------- = ---------

                            1,57 х Т      Т

Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3 воздуха содержится

                           12 х 636,9

                          -----------  = 253 клетки

                              30

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

     Протокол N

     количественного   микробиологического   анализа    штамма-продуцента

Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 в атмосферном воздухе.

1. Даты проведения анализа ______________________________________________

2. Место отбора пробы ___________________________________________________

3. Название лаборатории _________________________________________________

4. Юридический адрес организации ________________________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или N пробы | Определяемый | Концентрация, кл/м3 | микроорганизм | ----------------------+------------------------+-----------------------

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96.- М., 1991. - 693 с.

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений.

3. ГОСТ 17.2.4.02-81. Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ. - М: Изд-во стандартов, 1981.- 3 с.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г.Онищенко