Приложение А. Методы контроля

Приложение А

Методы контроля

В данном приложении рассматриваются преимущества и недостатки основных методов, используемых в микробиологическом мониторинге для тестирования воздушной среды, рабочих поверхностей, одежды и рук персонала.

Приведенный в данных Методических рекомендациях список литературы может помочь производителю в выборе приемлемых методов контроля.

1. Методы тестирования воздушной среды

Микроорганизмы потенциально всегда присутствуют в воздухе контролируемой рабочей зоны, т.к. НЕРА-фильтры, используемые для очистки, не имеют абсолютной 100% эффективности, даже тогда, когда работают в специфицированных условиях (класс чистоты А (100) и В (100).

Основной целью микробиологического контроля воздуха асептической зоны является определение уровня и спектра микробной контаминации, чтобы оценить вероятность ее проникновения в производимый продукт.

Для контроля микробной контаминации воздуха применяют два метода пассивный (качественный) и активный (количественный).

К числу наиболее популярных приборов, используемых в активных методах микробиологического контроля воздуха, относятся импакторы и центрифужные пробоотборники, где применяется плотная агаровая питательная среда.

Пассивный метод заключается в экспозиции открытой плотной питательной среды в течение определенного периода времени. Главным недостатком метода является выявление только больших быстрооседающих частиц и неопределенность в объеме отобранной пробы. Фактически данный метод является качественным и позволяет лишь определить спектр присутствующих микроорганизмов.

1.1. Активные методы и приборы для контроля микробной контаминации воздуха

Для выбора приемлемого метода активного отбора проб следует учитывать следующие факторы:

- ожидаемая концентрация КОЕ в воздушной среде;

- способность метода работать в условиях низкой концентрации КОЕ;

- чувствительность бактерий к процедуре пробоотбора;

- время и продолжительность отбора пробы;

- свойства прибора (эффективность, объемы проб);

- возможность деконтаминации прибора.

Выбор прибора и правильность его использования являются областью ответственности производителя.

Наиболее часто в фармацевтической промышленности используются щелевые импакторы и центрифужные пробоотборники типа RCS.

Учитывая приемлемость по основным характеристикам и удобство использования, рекомендуется применять аэрозольные пробоотборники типа "Флора-100" или Biotest RCS (см. приложение Б "Аэрозольные пробоотборники для контроля бактериальной контаминации воздуха").

1.2. Пассивный метод контроля микробной контаминации воздуха

Метод заключается в экспозиции плотной питательной среды в открытых чашках Петри.

Частицы, присутствующие в воздухе, со временем осаждаются на поверхность агара. Время экспозиции составляет от 15 мин до нескольких часов. Однако длительная экспозиция приводит к высыханию поверхности питательной среды и к ухудшению условий сохранения и культивирования бактерий.

Этот метод широко распространен и его применение целесообразно в сочетании с активным методом контроля микробной контаминации воздуха.

Открытые чашки Петри располагают в нескольких точках. Например, при розливе препаратов - как можно ближе к наполняющим иглам и в точки "наихудших условий". В асептических зонах класса А (100) и В (100) при экспозиции чашек Петри с питательной средой в течение 30 мин во время работы допускается рост одной, редко двух колоний.

Преимущества	Ограничения
Простота использования	Отбор только быстро оседающих больших частиц
Не требует процесса посева	Влияние температуры на эффективность сбора
Различные типы питательной среды могут быть использованы для проращивания плесени, грибов, всего спектра микроорганизмов или отдельного вида	Сильное влияние скорости и направления воздушного потока по отношению к поверхности среды на результаты теста
Очень экономичен	Неопределенность объема отобранной пробы

2. Методы отбора проб с поверхностей

Для контроля микробной контаминации рабочих поверхностей используются следующие методы:

- смыв;

- контактная пластина.

Репрезентативной считается проба, снятая с поверхности площадью от 24 до 30 см2.

Если накопленные результаты текущего мониторинга свидетельствуют о постоянном присутствии определенной группы микроорганизмов, то для их идентификации может быть использован соответствующий тип питательной среды.

Смывы с поверхностей проводят стерильным ватным тампоном, укрепленном на стеклянном или металлическом держателе, вмонтированном в ватно-марлевую пробку пробирки. В пробирке должно содержаться приблизительно 2 мл стерильной воды для инъекций.

В чашки Петри разливают по 20 - 25 мл питательной среды N 1 для бактерий и среды N 2 для грибов и дрожжей (по ГФ изд. XI, вып.2). Перед исследованиями чашки с разлитой средой выдерживают в термостате в течение 1 суток при температуре от 30 до 35°С. Проросшие чашки не используют.

Смывы проводят увлажненным тампоном с поверхности площадью от 24 до 30 см2.

После взятия пробы провести несколько раз по поверхности питательной среды в двух параллельных чашках Петри со средой N 1 и N 2. После отбора проб чашки Петри помещают в термостат для инкубации для среды N 1 при температуре от 30 до 35°С в течение 48 ч, для среды N 2 - от 20 до 25°С в течение 72 ч. После истечения срока инкубации проводят подсчет колоний на двух параллельных чашках, делают мазки, фиксируют их и окрашивают по Граму, микроскопируют.

На результаты тестирования могут повлиять следующие факторы:

- угол снятия пробы и давление тампона;

- присутствие остатков дезинфектантов на поверхностях;

- возможность повторного снятия мазка с того же участка поверхности.

Контактные пластины готовятся с соответствующей плотной питательной средой, разливая ее на специальные пластины или таким образом, чтобы поверхность агара выступала над краем чашки Петри.

При исследовании снимают крышку с чашки и стерильная поверхность питательной среды накладывается на гладкую ровную поверхность. После снятия отпечатка эту поверхность необходимо обработать спиртом или любым другим дезинфектантом для удаления остатков питательной среды. После инкубации в соответствии со сроками и температурой для используемых сред (например, среды N 1 и N 2) проводят подсчет колоний и микроскопируют окрашенные по Граму мазки. Метод контактных пластин подходит для тестирования гладких и ровных поверхностей, таких, как рабочий стол, стены, пол или одежда персонала.

3. Методы определения микробной контаминации одежды и перчаток персонала

3.1. Для определения микробной контаминации перчаток персонала используют следующий метод:

Отпечатки пяти пальцев каждой руки делают на поверхность плотной питательной среды, например, среды N 1 и среды N 2 (параллельно). Чтобы касание было полным, рекомендуется сделать скользящее движение пальцами по всей поверхности агара. Руки после контакта с агаром тщательно обрабатывают спиртом.

Рекомендуется следующая частота тестирования: не менее одного раза в рабочую смену для АПЗ, для других - от одного раза в неделю до одного раза в месяц, в зависимости от степени автоматизации технологического процесса.

3.2. Микробная контаминация одежды персонала обычно определяется на предплечьях с помощью контактных пластин. Также проверяются бахилы.

Можно применять метод смыва тампоном. Для этого делают смывы увлажненным тампоном с 4 участков площадью по 25 см2 каждый на нижней части двух рукавов, верхней передней поверхности комбинезона (халата) и шлеме.

После тестирования одежда не должна более использоваться в АПЗ.