Методические указания МУК 4.2.1174-02 "Использование модельных тестов цист лямблий и ооцист криптоспоридий для гигиенической оценки эффективности водоочистки" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 14 ноября 2002 г.)

Методические указания МУК 4.2.1174-02
"Использование модельных тестов цист лямблий и ооцист криптоспоридий для гигиенической оценки эффективности водоочистки"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 14 ноября 2002 г.)

Дата введения - 1 февраля 2003 г.

Введены впервые

1. Общие положения и область применения

1.1. Методические указания устанавливают методы приготовления модельных жидкостей, содержащих цисты лямблий и (или) ооцист криптоспоридий, и применения их для гигиенической оценки эффективности водоочистки различными технологиями.

2. Нормативные ссылки

2.1. МУК 4.2.964-00 "Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого назначения".

2.2. МУК 4.2.796-99 "Методы санитарно-паразитологических исследований".

2.3. МУК 4.2.735-99 "Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов".

2.4. СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".

2.5. СанПиН 2.1.2.568-96 "Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды плавательных бассейнов".

ГАРАНТ:

Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 30 января 2003 г. N 5 Санитарные правила СанПиН 2.1.2.568-96 признаны утратившими силу с 1 мая 2003 г. См. санитарно-эпидемиологические правила и нормативы "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества. СанПиН 2.1.2.1188-03", утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 30 января 2003 г. N 4

2.6. СанПиН 3.2.563-96 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации".

2.7. ГОСТ 2874-82 "Вода питьевая. Контроль за качеством".

2.8. СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

3. Методика подготовки модельного теста с цистами лямблий и использования его для оценки эффективности водоочистных технологий

3.1. Этапы проведения методики

3.1.1. Подготовка модельной жидкости (воды), содержащей определенное (не менее 15) число лямблий в 1 дм3 (л).

3.1.2. Обработка не менее 50 дм3 модельной жидкости (1 проба) на испытуемом водоочистном устройстве (фильтрация, адсорбция, разрушение и прочие способы инактивации цист) как минимум в 3-х повторностях.

3.1.3. Контроль за содержанием цист лямблий и их жизнеспособностью в конечном продукте, получаемом после обработки модельной жидкости на испытуемом устройстве.

3.1.4. Оценка эффективности барьерной функции в отношении цист лямблий и выдачи соответствующего заключения.

3.2. Подготовка модельной жидкости

Лаборатории, осуществляющие сертификационные испытания водоочистных устройств по паразитологическому показателю, должны иметь запас максимально очищенной взвеси цист лямблий (Giardia lamblia - Lamblia intestinalis) в объеме не менее 25 мл с содержанием цист не менее 10 000 экз. в 1 мл.

При испытании водоочистных устройств, использующих химические и физические (УФ-лучи, МИО, озон и др.) факторы воздействия, используются только жизнеспособные тест-объекты. Цисты лямблий, выделенные из фекалий человека, сохраняют свою жизнеспособность в полном объеме в течение 10 суток при условии хранения их при 4°С.

3.2.1. Материалом для получения жизнеспособных цист лямблий могут служить фекалии больных лямблиозом лиц и лиццистоносителей. Материал может быть получен в инфекционных больницах (особое внимание должно быть обращено на детские отделения), кишечных кабинетах поликлиник, гастроэнтерологических отделениях больниц и клиник, паразитологических лабораториях центров Госсанэпиднадзора.

Специалист, осуществляющий подготовку взвесей тест-объектов, должен руководствоваться СП 1.2.731-99 (п. 28).

Цисты лямблий выделяют из оформленных или полуоформленных фекалий инвазированных лямблиями людей. Для этого используются методы обнаружения цист лямблий, описанные в нормативно-методических документах МУК 4.2.735-99 (п.п. 2.3).

Фекалии, в которых обнаруживаются цисты лямблий более 100 экз. в одном поле зрения при 200-кратном увеличении микроскопа (окуляр х 10, объектив х 20), следует подвергать соответствующей дальнейшей обработке.

3.2.1.1. Для получения взвеси цист лямблий фекалии, их содержащие, в количестве 3-5 г (чайная ложка) отмывают изотоническим раствором (0,85%) хлорида натрия (NaCl) путем повторного центрифугирования (3 мин х 1 500 об./мин) до образования прозрачной надосадочной жидкости, которую осторожно удаляют путем пипетирования. В оставшийся осадок фекалий добавляют флотирующий раствор объемом, в 3-4 раза превышающим объем фекалий (рис. 1).

3.2.1.2. В качестве флотационной жидкости используется насыщенный (30%) раствор сахарозы (насыщение достигается при условии нерастворения кристаллов сахарозы в воде с температурой около 50°С при перемешивании или встряхивании).

Раствор следует остудить до 18-20°С. Обработка осадка фекалий флотирующим раствором должна сопровождаться интенсивным перемешиванием с помощью пипетки или стеклянной палочки.

Для ускорения перехода цист лямблий из осадка в поверхностную пленку флотанта и очищения их, пробирки центрифугируют при 1 500 об./мин в течение 5 мин.

После 10-15-минутной экспозиции поверхностную пленку флотанта снимают металлической петлей (из медной или алюминиевой проволоки) с внутренним диаметром 5-6 мм и переносят в пробирку с изотоническим раствором хлорида натрия или жидкости Барбагалло (3%-ным раствором формальдегида на физиологическом растворе). Процедуру повторяют не менее 3-х раз. Вместо петли можно использовать пипеточный дозатор 0,1 мл, которым осторожно снимают поверхностную пленку. Для получения концентрированной взвеси цист в работе должно быть задействовано 10 и более пробирок (емкостью 10-15 мл) с фекалиями и флотантом.

3.2.1.3. Для более высокой очистки взвеси цист от фекального загрязнения ее подвергают дополнительной обработке 8%-ным раствором сахарозы следующим образом: взвесь цист центрифугируют 3 мин при 1 500 об./мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок осторожно переносят на поверхность 8%-ного раствора сахарозы (6 мл и более) в центрифужной пробирке. Эту суспензию вновь центрифугируют в течение 2 мин при 2 000 об./мин. Надосадочную жидкость удаляют, а взвесь, обогащенную отмытыми цистами, хранят в пробирках с резиновыми пробками при 4°С.

Жизнеспособность отмытых цист при данном режиме консервации сохраняется в течение 10 суток. Даже если суспензия не подвергалась дополнительно очистке, ее следует освободить от остатков сахарозы путем 2-3-кратного промывания, что резко снизит возможность развития в суспензии плесени и бактериальной флоры.

При получении взвеси формалинизированных цист лямблий в качестве начального этапа обработки фекалий может быть использована методика формалин-эфирного осаждения (см. МУК 4.2.735-99, стр. 13, 14, 25, 26). При этом могут быть использованы и фекалии, законсервированные в фиксирующих жидкостях (Барбагалло, Турдыева и др.).

Полученный после такой процедуры осадок, содержащий цисты лямблий, подвергается затем флотации выше описанным способом. При этом в качестве флотанта можно использовать 33%-ный водный раствор семиводного сернокислого цинка (ZnSО4 Н2О).

3.2.2. Количественное определение цист лямблий в полученной взвеси. Взвесь интенсивно встряхивают путем постукивания пальцем по пробирке или размешивания стеклянной палочкой. Пипеточным дозатором отбирают 0,1 мл и переносят на предметное стекло. Образовавшуюся на стекле каплю накрывают покровным стеклом и микроскопируют при 200-кратном увеличении микроскопа (окуляр х 10, объектив х 20). При таком увеличении микроскопа покровное стекло размером 24 х 24 мм накрывает площадь, соответствующую 2 935 полям зрения. Просматривают не менее 20 полей зрения и подсчитывают число цист лямблий в каждом из них. Числа суммируют и делят на число просмотренных полей; получается среднее число цист в одном поле зрения. Это число умножают на 2935 и получают усредненное число цист, содержащихся в 0,1 мл взвеси. При умножении на 10 получают содержание в 1 мл взвеси с поправкой +-5%. Это - маточная взвесь, которая должна содержать около 200 000 цист лямблий в 1 мл.

3.2.2.1. Концентрация цист лямблий в 1 мл взвеси, предназначенной для приготовления модельной жидкости (рабочая суспензия), должна составлять не менее 2 000 единиц. Если она менее этих цифр, то ее корректируют добавлением более концентрированной взвеси. Если содержание цист превышает 10% обозначенной нормы, то суспензию разводят.

3.2.2.2. Взвесь тест-объектов (цисты лямблий) вносят в воду объемом не менее 50 л (дм3), предназначенную для приготовления модельной жидкости с таким расчетом, чтобы содержание их в 1 л (дм3) модельной жидкости составляло, как минимум, 15 +-2 единицы. Оптимальный вариант 20 +-2 единицы. Это достигается внесением 0,01 мл рабочей взвеси на каждый литр модельной жидкости или 0,5 мл на 50 л. Таким образом, общее число цист в пробе модельной жидкости должно находиться в пределах 750-1 000 единиц. Модельную жидкость затем тщательно (1-1,5 мин) размешивают.

3.2.3. Для приготовления модельной жидкости может быть использована вода из распределительной сети водопровода при условии ее соответствия ГОСТ 2874-82 "Вода питьевая. Контроль за качеством по биологическим и микробиологическим показателям". При несоответствии ее ГОСТ должна быть использована вода, предназначенная для фармацевтических нужд или дистиллированная.

3.3. Проведение обработки модельной жидкости на испытуемом устройстве

Обработка модельной жидкости на водоочистном устройстве проводится в соответствии с инструкцией по эксплуатации данного устройства. Обрабатывается не менее 3-х проб (по 50 л) модельной жидкости.

3.4. Контроль за содержанием цист лямблий и их жизнеспособностью в конечном продукте после технологической обработки

Модельная жидкость после обработки на водоочистном устройстве исследуется на наличие цист лямблий в соответствии с действующими нормативными документами и оценочными показателями паразитарной безопасности (п. 2.4).

Полученный после обработки на водоочистном устройстве модельной жидкости продукт ("очищенная вода") исследуется на наличие цист лямблий в соответствии с МУК 4.2.964-00 (п. 2.1). Конечный продукт (очищенная вода), получаемый на водоочистных устройствах фильтрационного и абсорбционного действия, не должен содержать в 50 л цист лямблий (п. 2.4). Конечный продукт, получаемый на водоочистных устройствах реагентного и физического воздействия, не должен содержать жизнеспособных цист лямблий. Жизнеспособность определяется в соответствии с методикой, изложенной в МУК 4.2.964-00 или с помощью обработки материала, подготовленного к микроскопии, 1 каплей 0,2%-ного водного раствора акридинового оранжевого; при этом жизнеспособные цисты лямблий не окрашиваются, а инактивированные цисты окрашиваются в желто-коричневый цвет.

3.5. Оценка эффективности барьерной функции водоочистного устройства

При отсутствии цист лямблий в 3-х пробах конечного продукта эффективность противопаразитарной барьерной функции испытуемого водоочистного устройства фильтрационного или абсорбционного действия оценивается как 100%-ная.

При обнаружении в конечном продукте одной цисты эффективность устройства оценивается в 99,96%.

При обнаружении большего числа цист лямблий в 3-х пробах конечного продукта эффективность барьерной функции водоочистного устройства рассчитывается по формуле:

                                    в - с

                                А = ----- х 100,

                                      в

где

А - эффективность барьерной функции, %;

в - число цист лямблий, внесенное в 3 пробы модельной жидкости (в среднем

    около 3 000 единиц);

с - число цист лямблий, обнаруженное в 3-х пробах конечного продукта.

При оценке барьерной функции водоочистного устройства реагентного действия формула расчета эффективности выглядит так:

                                Д - д

                            А = ------ х 100,

                                  Д

где

А - эффективность барьерной функции устройства, %;

Д - число   жизнеспособных   цист,   внесенное   в   модельную   жидкость

    (в 3 пробы);

д - число жизнеспособных цист, обнаруженное в конечном продукте.

3.6. Оборудование и материалы

3.6.1. Оборудование, перечень материалов (реактивов) - см. МУК 4.2.964-00, стр. 6-8; дополнение: акридиновый оранжевый ЧДА.

3.6.2. Приготовление рабочих растворов. 33%-ный водный раствор семиводного сульфата цинка: 331 г семиводного сульфата цинка растворяют в 1 л кипящей дистиллированной воды; 30%-ный водный раствор сахарозы: 300 г сахарозы чда растворяют в 1 л горячей (70-80°С) дистиллированной воды. После приготовления флотанта и снижения его температуры до 18°С контролируют его удельную плотность ареометром. Она должна составлять 1,2.

Приготовление рабочего раствора акридинового оранжевого - 0,2 г красителя растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

4. Методика подготовки модельного теста ооцист криптоспоридий и использования его для оценки эффективности водоочистных технологий

Этапы методики те же, что и для цист лямблий (см. п. 3.1).

4.1. Подготовка модельной жидкости

Материалом для получения ооцист криптоспоридий могут быть фекалии молодняка домашних животных (телят, поросят и др.). Материал может быть получен на животноводческих комплексах и фермах.

Методы исследования фекалий для диагностики криптоспоридиоза представлены в МУК 4.2.735-99 (см. п. 2.3.) и работе Т.В.Бейер "Лабораторная диагностика криптоспоридиоза у детей" (Л., 1987), и с учетом работы с микроорганизмами III-й группы патогенности (см. п. 2.8).

4.1.1. Получение очищенной взвеси ооцист криптоспоридий. Фекалии, их содержащие, в количестве 3-5 г (чайная ложка) помещают в центрифужные пробирки емкостью 30-50 мл и отмывают изотоническим раствором хлорида натрия (0,85%) путем повторного центрифугирования (3 мин при 1 500 об./мин) до образования прозрачной надосадочной жидкости, которую осторожно удаляют путем пипетирования (прилож. 2, рис. 1 и 2).

4.1.2. Осадок заливают 30%-ным раствором сахарозы при t = 30-35°С в количестве, равном трем объемам осадка, и маркером отмечают верхний уровень жидкости.

4.1.3. Проводят тщательное размешивание стеклянной палочкой или пипеткой и центрифугируют в режиме 2 000 об./мин в течение 5 мин. После центрифугирования смеси дают отстояться 15 мин. Затем на поверхность флотанта осторожно наслаивают 10-15 мл дистиллированной воды и очень осторожно с помощью стеклянной палочки эту воду над раствором сахарозы (граница между сахарозой и водой отмечена маркером) слегка помешивают, чтобы ооцисты, находящиеся в верхнем слое флотанта, переместились из верхнего слоя сахарозы в находящуюся над ней воду. Эту воду затем с помощью пипеточного дозатора отсасывают до отмеченного маркером уровня и переносят в чистую пробирку емкостью 50 мл, размешивают и центрифугируют в прежнем режиме до образования прозрачной жидкости. Промывку ооцист с помощью центрифугирования повторяют не менее 4 раз.

4.1.4. После последнего промывания и осторожного удаления надосадочной жидкости (пипетированием) оставшийся осадок переносят в центрифужные пробирки емкостью 10 мл и центрифугируют при 3 000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют путем пипетирования, а образовавшуюся после всех манипуляций взвесь ооцист используют в дальнейшей работе.

4.1.5. Количественное определение содержания ооцист в полученной взвеси проводят аналогичным для цист лямблий путем либо подсчетом в камере Горяева. Ооцисты подсчитывают в 20 прямоугольниках (полученное число соответствует их содержанию в 2 мм3), сумму умножают на 50 000 и получают содержание ооцист в 1 мл взвеси.

Дальнейшую работу проводят в соответствии с пунктами 3.2.2.1-3.3.

4.2. Контроль за содержанием ооцист криптоспоридий в конечном продукте после технологической обработки

Конечный продукт ("очищенная вода") не должен содержать ооцист криптоспоридий. Исследование проводят в соответствии с МУК 4.2.964-00 (см. п. 2.1). Далее полученный осадок распределяют равномерно на предметных стеклах (не менее 4-х) и высушивают на воздухе. На тщательно высушенный мазок наносят 2-3 капли смеси Никифорова (смесь равных частей серного эфира и 96°-ного этилового спирта) на 8-12 мин. После чего предметные стекла ставят вертикально и тщательно высушивают.

После этого мазки быстро проводят над пламенем горелки и окрашивают карболовым фуксином (см. раздел 4.3) в течение не менее 20 мин. Мазки промывают дистиллированной водой, обесцвечивают (дифференцируют) 5-10%-ной серной кислотой в течение 10-20 с и снова промывают. Затем дополнительно окрашивают 0,2%-ным водным раствором метиленового синего или 5% малахитовой зелени в 10%-ном этиловом спирте в течение 3-5 мин. Промывают дистиллированной водой, тщательно высушивают на воздухе и исследуют с масляной иммерсионной системой микроскопа с увеличением не менее 1 000 х.

Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований диаметром 5-6 микрон с отчетливо видимой оболочкой и структурированным содержимым (можно наблюдать наличие 4-х веретенообразных темноокрашенных спорозоитов) на синем или зеленом основном фоне.

4.3. Оценка эффективности барьерной функции водоочистного устройства

Оценку эффективности проводят также, как и в отношении цист лямблий (см. 3.5).

4.4. Оборудование и материалы

Оборудование и материалы аналогичны тем, которые применяются для анализа цист лямблий (см. раздел 3.6).

4.4.1. Камера Горяева.

4.4.2. Дополнение 1: фуксин основной чда, фенол чда, малахитовая зелень чда, метиленовый синий чда, серная кислота (10%), масло иммерсионное пихтовое.

4.4.3. Дополнение 2: приготовление карболового фуксина (по Цилю-Нильсену): 2,0 основного фуксина разводят в 12 мл 96°-ного этилового спирта, а 5,0 мл фенола разводят в 100 мл дистиллированной воды при 30-35°С, затем оба этих раствора соединяют вместе. Срок хранения смеси - 2 месяца.

Приготовление раствора малахитовой зелени: 5,0 малахитовой зелени растворяют в 100 мл 10%-ного этилового спирта. Срок хранения - 2 месяца.

Библиографические данные

1. Бейер Т.В. и соавт. Лабораторная диагностика криптоспоридиоза у детей. Л., 1987. 21 с.

2. Бейер Т.В. и соавт. Диагностика, клиника, лечение и профилактика криптоспоридиоза: Методические рекомендации. Л., 1987. 22 с.

3. Романенко Н.А., Новосильцев Г.И., Сергиев В.П. и др. О необходимости включения ооцист криптоспоридий в число показателей эпидемиологической безопасности питьевой воды на территории Российской Федерации//Материалы 4 Международного конгресса "Вода, экология и технология". М., 2000. С. 773.

4. Тумка А.Ф. Паразитология, эпидемиология и лабораторная диагностика кишечных протозойных инфекций. Л.: "Медицина",1967. 139 с.

5. Шарапов М.Д. Совершенствование и применение метода культивирования лямблий для изучения некоторых вопросов эпидемиологии лямблиоза//Дисс. канд. мед. наук. М., 1977.

6. Ford Т.Е. Microbiology Safety of drinking water: United States and Global Perspectives//Environm. Health Perspectives. 1999. V. 107, S. 1.

7. Pavlasek I. Kryptosporidie: biologic, diagnostica, hostitelske spektrum, specifita a vztah k zivotinu prostredi. Remedia - Klinicka mikrobiologie 1999: 3 (9) S. 290-300.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г.Онищенко