Приложение 7. Методика приготовления биотестов, используемых для контроля работы воздушных стерилизаторов, и культивирования тест-культуры B.licheniformis штамм G после стерилизации

Приложение 7

Методика приготовления биотестов, используемых для контроля работы воздушных стерилизаторов, и культивирования тест-культуры B.licheniformis штамм G после стерилизации

1. Штамм бактерий B.licheniformis G выделен в 1984 году при контроле стерильности чашек Петри, подвергнутых стерилизации сухим горячим воздухом.

Подвижная грамположительная палочка. Споры эллиптические, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (рН 7,3+-0,1) через 48 часов инкубации при температуре 37+-1°С образует помутнение среды, на поверхности сухую пленку; на мясопептонном агаре (рН 7,3+-1) - слабо выпуклые сухие колонии вытянутой звезчатой формы с неровными краями диаметром 4-6 мм, врастающие в питательную среду. Штамм непатогенен для человека и животных.

2. Ампулу с лиофилизированной культурой B.licheniformis штамм G вскрывают аналогично приложению 5.1, п. 2. Суспензию переносят по 1-2 капли в две пробирки с бульоном (бульон Хоттингера, питательный бульон сухой, мясопептонный бульон), содержащим 0,5% глюкозы.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду приложение 5, п. 2

Посевы инкубируют при температуре 37+-1°С в течение 24 часов. При росте культуры происходит помутнение питательной среды.

3. Суточную бульонную культуру бактериологической петлей или пастеровской пипеткой по 1-2 капли пересевают в 10-20 пробирок на скошенную питательную среду (агар Хоттингера, питательный агар сухой, мясопептонный агар).

Посевы инкубируют при температуре 37+-1°С в течение 24 часов.

4. Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде (п. 3), бактериологической петлей пересевают в бактериологические пробирки или смывают 5 мл стерильной дистиллированной воды и переносят во флаконы вместимостью 250-500 мл (10-20 штук в зависимости от потребности в суспензии спор), содержащие соответственно 100-200 мл скошенного агара (пшеничный агар, картофельный агар).

Для обсеменения каждого флакона в зависимости от его вместимости используют суспензию, смытую с 1-2 пробирок соответственно. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды. Флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками и инкубируют при температуре 37+-1°С в течение 7-10 суток в наклонном положении (под углом 45°) агаром вверх.

5. На 5, 7 и 10 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования (выборочно 2-3 флакона) аналогично прил. 6, п. 5.

6. После завершения споруляции культуру осторожно при помощи шпателя из проволоки смывают с поверхности агара 5-10 мл стерильной дистиллированной воды в зависимости от вместимости флакона.

7. Для удаления вегетативных клеток полученную суспензию прогревают при температуре от 65 до 70°С в течение 30 минут в водяной бане (экспозиция с момента достижения температуры на термометре, опущенном в контрольную аналогичную емкость с таким же количеством воды), центрифугируют в стерильных центрифужных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, с частотой вращения 33,33 с(-1) (2000 об/мин) в течение 15 минут. Далее надосадочную жидкость осторожно удаляют, а осадок трехкратно промывают стерильной дистиллированной водой, чередуя с центрифугированием, после чего споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:1 по объему.

8. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками. Срок хранения 2 года.

9. Для получения культуры производят высев из пробирок с суспензией, заложенной на хранение, в пробирки с бульоном (бульон Хоттингера, питательный бульон сухой, мясопептонный бульон), содержащим 0,5% глюкозы (2 пробирки), и далее получают споры по описанной выше методике (прил. 7, п. 2-7).

10. Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на чашки Петри с агаром (агар Хоттингера, мясопептонный агар).

11. Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии пипеткой переносят в пробирку, содержащую 0,9 мл стерильной дистиллированной воды (разведение 10(-1). Подобным образом последовательно получают десятикратные разведения культуры, меняя пипетку для каждого разведения. Из трех последовательных десятикратных разведений исходной суспензии (предел разведения зависит от титра полученных спор - ориентировочно от 10(-7) до 10(-9)) производят высев по 0,1 мл суспензии на поверхность трех чашек Петри с агаром (агар Хоттингера, мясопептонный агар).

Чашки Петри инкубируют при температуре 37+-1°С в течение 48 часов, после чего производят подсчет выросших колоний.

12. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют аналогично приложению 6, п. 12.

13. В качестве носителей тест-культуры B.licheniformis штамм G используют флаконы, чашечки из алюминиевой фольги или диски из фильтровальной бумаги. Флаконы тщательно моют, закрывают ватно-марлевыми пробками. Из алюминиевой фольги, фильтровальной бумаги вырезают диски диаметром 14 мм, неоточенной стороной карандаша в дисках из алюминиевой фольги делают вдавление - луночку.

14. Подготовленные носители стерилизуют паровым методом при температуре 120+2°С, время стерилизационной выдержки 45 минут или воздушным методом при температуре 180(+2)-10°С, время стерилизационной выдержки 60 минут в упаковке из бумаги (чашечки из фольги и диски из фильтровальной бумаги раскладывают в чашки Петри).

15. Стерильные носители с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) обсеменяют суспензией спор тест-культуры B.licheniformis штамм G из расчета 5 х 10(2) - 5 х 10(3) спор на носитель, что достигается нанесением на каждый носитель 0,02 мл суспензии спор в дистиллированной воде титром 2,5 х 10(4) - 2,5 х 10(5) спор в 1 мл.

16. Носители высушивают в термостате при температуре 37+-1°С или эксикаторе под осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 часов.

17. Каждый биотест закладывают в пакет из упаковочной бумаги (флаконы без ватно-марлевых пробок во избежание возгорания) или заворачивают в бумагу упаковочную по типу порошка (чашечки из алюминиевой фольги, диски из фильтровальной бумаги), раскладывают в полиэтиленовые пакеты, маркируют и запаивают.

18. Для определения фактической плотности обсеменения используют не менее трех биотестов от каждой партии. Во флаконы вносят 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги и диски из фильтровальной бумаги отмывают в бактериологических пробирках с бусами в 1 мл) и встряхивают в течение 10 минут на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на поверхность трех чашек Петри с агаром (агар Хоттингера, питательный агар сухой, мясопептонный агар) по 0,1 мл суспензии из исходной суспензии и двух последовательных десятикратных разведений исходной суспензии. Среднее число спор в биотесте должно быть в соответствии с прил. 7, п. 15.

19. Определение устойчивости спор тест-культуры B.licheniformis штамм G к действию сухого горячего воздуха проводят при температуре 160+-2°С в воздушных стерилизаторах с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха более 1 м/с, которые обеспечивают допустимые перепады от номинального значения температуры (ГП-20, ГП-40, ГП-80).

Биотесты в упаковочной бумаге помещают на полку воздушного стерилизатора, предварительно прогретого до 160°С при исследовании биотестов с использованием чашечек из алюминиевой фольги и дисков из фильтровальной бумаги и до 140°С при использовании флаконов в качестве носителей. Стерилизатор закрывают и после достижения температуры 160+-2°С начинают отсчет времени воздействия. Через 4 минуты времени выдержки (время выдерживания спор тест-культуры на носителе) аппарат отключают.

Аналогичное исследование проводят в течение 30 минут времени выдержки (время гибели спор тест-культуры на носителе).

Контроль температуры осуществляют по наружному термометру.

По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора. Культивирование тест-культуры B.licheniformis штамм G осуществляют в бактериологической лаборатории в соответствии с прил. 5, п. 11-19.

20. Партию биотестов считают годной для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры B.licheniformis штамм G соответствуют требованиям, указанным в таблице.

Таблица

Наименование показателя	Норма	Метод исследования
Устойчивость спор тест-культуры B.licheniformis штамм G на носителе к действию сухого горячего воздуха температурой 160+-2°С в воздушном стерилизаторе
- время выживания	не менее 4 минут для каждого образца	по приложению 7, п. 19
- время гибели	не более 30 минут для каждого образца	по приложению 7, п. 19

21. Для культивирования тест-культуры B.licheniformis штамм G используют питательный бульон (бульон Хоттингера, питательный бульон сухой, мясопептонный бульон, бульон из перевара кровяных сгустков, полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным), содержащий 0,5% глюкозы, среду питательную для контроля стерильности.

Биотесты инкубируют при температуре 37+1°С в течение 7 суток.

22. Учет результатов бактериологического контроля проводят в соответствии с приложением 5, п. 13-18.