Приложение 6. Методика приготовления биотестов, используемых для контроля работы паровых стерилизаторов, и культивирования тест-культуры B.stearothermophilus BKM В-718 после стерилизации

Приложение 6

Методика приготовления биотестов, используемых для контроля работы паровых стерилизаторов, и культивирования тест-культуры B.stearothermophilus BKM В-718 после стерилизации

1. Штамм бактерий B.stearothermophilus BKM В-718 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

Подвижная термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно, культивируется при температуре 55+-1°С, исключающей развитие других широко распространенных микроорганизмов. Споры овальные, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (рН 7,3+-0,1) через 24 часа образует помутнение среды; на мясопептонном агаре (рН 7,3+-0,1) - слабо выпуклые колонии диаметром 2-4 мм с ровным краем. Штамм непатогенен для человека и животных.

2. Ампулу с лиофилизированной культурой B.stearothermophilus BKM В-718 вскрывают в асептических условиях следующим образом: тампоном ваты, смоченным этиловым спиртом, обрабатывают поверхность ампулы. Затем, держа ампулу в левой руке, нагревают ее запаянный конец в пламени. Чтобы на ампуле образовалась трещина, к накаленному концу ампулы прикладывают ватную пробку, смоченную стерильной водой. После этого металлическим инструментом (скальпель, пинцет) откалывают по трещине конец ампулы. Стерильной пастеровской пипеткой в ампулу вливают 0,2 мл стерильной водопроводной воды и оставляют в течение 30 минут при комнатной температуре. Суспензию отсасывают стерильной пастеровской пипеткой и переносят по 1-2 капли в две пробирки с бульоном (бульон Хоттингера, питательный бульон сухой, мясопептонный бульон), содержащим 0,5% глюкозы.

Посевы инкубируют при температуре 55+-1°С в течение 24 часов. При росте культуры происходит помутнение питательной среды.

3. Суточную бульонную культуру бактериологической петлей или пастеровской пипеткой (по 1-2 капли) пересевают в 10-20 пробирок на скошенную питательную среду (агар Хоттингера, питательный агар сухой, мясопептонный агар).

Посевы инкубируют при температуре 55+-1°С в течение 24 часов.

4. Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде (п. 3), смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы вместимостью 250-500 мл (10-20 штук в зависимости от потребности в суспензии спор), содержащие соответственно 100-200 мл скошенного картофельнопептонного агара. Для обсеменения каждого флакона в зависимости от его вместимости используют суспензию, смытую с 1-2 пробирок соответственно. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды. Флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками и инкубируют при температуре 55+-1°С в течение 10-12 суток в наклонном положении (под углом 45°) агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой (до 2 л на термостат вместимостью 80 л).

5. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования (выборочно 2-3 флакона). Культуру забирают петлей с верхнего, среднего и нижнего участков агара, все три пробы растирают вместе на одном предметном стекле, распределяя тонким слоем. Мазок фиксируют, окрашивают по Граму или генцианвиолетом (по Синеву). Окрашенные препараты промывают водопроводной водой, подсушивают и микроскопируют с иммерсионной системой - споры имеют вид неокрашенных пустот, находящихся внутри клеток. Исследуют 3-5 полей зрения, подсчитывают количество спор, выражая в процентах. Достаточным количеством считают 80-90% спор в поле зрения от общего числа клеток.

6. После завершения споруляции культуру осторожно при помощи шпателя из проволоки смывают с поверхности агара 5-10 мл стерильной дистиллированной воды в зависимости от вместимости флакона.

7. Для удаления вегетативных клеток и получения чистых спор суспензию прогревают при температуре от 65 до 70°С в течение 30 минут в водяной бане (экспозиция с момента достижения температуры на термометре, опущенном в контрольную аналогичную емкость с таким же количеством воды), центрифугируют в стерильных центрифужных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, с частотой вращения 33,33 с(-1) (2000 об/мин) в течение 15 минут. Надосадочную жидкость осторожно удаляют, а осадок трехкратно промывают стерильной дистиллированной водой, чередуя с центрифугированием, после чего споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:1 по объему.

8. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками. Срок хранения - 2 года.

9. Для получения культур производят высев из пробирок с суспензией, заложенной на хранение, в пробирки с бульоном (бульон Хоттингера, питательный бульон сухой, мясопептонный бульон), содержащим 0,5% глюкозы (2 пробирки), и далее получают споры по описанной выше методике (прил. 6, п. 2-7).

10. Чистоту культур на всех этапах культивирования контролируют высевом на чашки Петри с агаром (агар Хоттингера, питательный агар сухой, мясопептонный агар).

11. Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии пипеткой переносят в пробирку, содержащую 0,9 мл стерильной дистиллированной воды (разведение 10(-1)). Подобным образом последовательно получают десятикратные разведения исходной суспензии, меняя пипетку для каждого разведения. Из трех последовательных десятикратных разведений исходной суспензии (предел разведения зависит от титра полученных спор - ориентировочно от 10(-5) до 10(-7)) производят высев по 0,1 мл суспензии на поверхность трех чашек Петри с агаром (агар Хоттингера, сухой питательный агар).

Чашки Петри инкубируют при температуре 55+-1°С в течение 48 часов, после чего производят подсчет выросших колоний.

12. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое числа колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Пример расчетов. Предположим, что при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1:100000 (10(-5) подсчитано 140, 110 и 134 колонии. Аналогичные высевы из разведений 1:1000000 (10(-6)) привели к образованию 12, 14 и 16 колоний; 1:10000000 (10(-7)) - 5, 3 и 7 колоний.

Вычисляем общее число колоний, найденных во всех трех чашках Петри соответствующих разведений:

1:100000 (10(-5)) 140 + 110 + 130 = 348

1:1000000 (10(-6)) 12 + 14 + 16 = 42

1:10000000 (10(-7)) 5 + 3 + 7 = 15

Среднее число колоний на чашках составит для разведения

1:100000 (10(-5)) 384:3 = 128

1:1000000 (10(-6)) 42:3 = 14

1:10000000 (10(-7)) 15:3 = 5

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем титр жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведений, далее находим средние арифметические числа колоний:

128 х 10 х 10(5) = 12,8 х 10(7).

14 х 10 х 10(6) = 14,0 х 10(7).

5 х 10 х 10(7) = 50,0 х 10(7).

Таким образом, титр исходной суспензии составит:

(12,8 + 14,0 + 50,0) х 10(7):3 = 25,6 х 10(7) = 2,5 х 10(8) спор в 1 мл.

13. В качестве носителей тест-культуры B.stearothermophilus ВКМ В-718 используют флаконы или чашечки из алюминиевой фольги. Флаконы тщательно моют, закрывают ватно-марлевыми пробками. Из алюминиевой фольги вырезают диски размером 14 мм, неоточенной стороной карандаша в дисках делают вдавление - луночку.

14. Подготовленные носители стерилизуют паровым методом при температуре 120+2°С, время стерилизационной выдержки 45 минут или воздушным методом при температуре 180(+2)-10°C, время стерилизационной выдержки 60 минут в упаковке из бумаги (чашечки из фольги раскладывают в чашки Петри).

15. Стерильные носители с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) обсеменяют суспензией спор тест-культуры B.stearothermophilus ВКМ В-718 из расчета 5 х 10(5) - 5 х 10(6) спор на носитель, что достигается нанесением на каждый носитель 0,02 мл суспензии спор в дистиллированной воде титром 2,5 х 10(7) - 2,5 х 10(8) спор в 1 мл.

16. Носители высушивают в термостате при температуре 37+-1°С или эксикаторе под осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 часов.

17. Каждый биотест закладывают в пакет из упаковочной бумаги (флаконы) или заворачивают в бумагу упаковочную по типу порошка (чашечки из алюминиевой фольги), раскладывают в полиэтиленовые пакеты, маркируют и запаивают.

18. Для определения фактической плотности обсеменения используют не менее трех биотестов от каждой партии. Во флаконы вносят 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10 мл) и встряхивают в течение 10 минут на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на поверхность трех чашек Петри с агаром (агар Хоттингера, питательный агар сухой) по 0,1 мл суспензии из трех последовательных десятикратных разведений исходной суспензии. Среднее число спор в биотесте должно быть в соответствии с приложением 6, п. 15.

19. Определение устойчивости спор тест-культуры B.stearothermophilus BKM В-718 к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре 120+2°С.

Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора (ВК-75). После набора давления в водопаровой камере (0,11+-0,1) МПа (1,1+-0,1 кгс/см2) проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 минут (при открытом спускном кране и давление в стерилизационной камере от 0,01 до 0,02 МПа (от 0,1 до 0,2 кгс/см2). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до 0,11 +-0,01 МПа (1,1+-0,1 кгс/см2), температура 120+2°С и через 5 минут времени выдержки (время выживания спор тест-культуры на носителе) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 минут, спуск - в течение 3 минут.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 минут времени выдержки (время гибели спор тест-культуры на носителе).

Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами.

По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора. Культивирование тест-культуры B.stearothermophilus BKM В-718 осуществляют в бактериологической лаборатории в соответствии с приложением 5, п. 11-19.

Таблица

Показатели устойчивости тест-культуры B.stearothermophilus ВКМ В-718 на носителе к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением

Наименование показателя	Норма	Метод испытания
Устойчивость спор тест-культуры B.stearothermophilus ВКМ В-718 на носителе к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением при температуре (120+2)°С в паровом стерилизаторе
- время выживания	не менее 5 минут для каждого образца	по приложению 6, п. 19
- время гибели	не более 15 минут для каждого образца	по приложению 6, п. 19

20. Партию биотестов считают годной для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры B.stearothermophilus ВКМ В-718 соответствуют требованиям, указанным в таблице.

21. Для культивирования тест-культуры B.stearothermophilus ВКМ В-718 используют питательный бульон (бульон Хоттингера, питательный бульон сухой, мясопептонный бульон, бульон из перевара кровяных сгустков, полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным), содержащий 0,5% глюкозы.

Биотесты инкубируют при температуре 55+-1°С в течение 7 суток.

22. Учет результатов бактериологического контроля проводят в соответствии с прил. 5, п. 13-18.