Приложение 5. Методика приготовления биотестов, используемых для контроля работы паровых и воздушных стерилизаторов и культивирования тест-культур после стерилизации

Приложение 5

Методика приготовления биотестов, используемых для контроля работы паровых и воздушных стерилизаторов и культивирования тест-культур после стерилизации

1. Приготовление биотестов осуществляют в боксе, специально оборудованной комнате или шкафу с ламинарным потоком воздуха с соблюдением асептики.

2. Для проведения работы ежедневно помещения боксов и предбоксника подвергают тщательной обработке. Стены, пол, поверхности инвентаря протирают 3% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства (Триас-А, Астра, Лотос). В случае обнаружения в воздухе грибов или споровых форм микроорганизмов влажную уборку проводят 6% раствором перекиси водорода с 0,5% выше перечисленных моющих средств.

Внутреннюю поверхность настольного бокса обрабатывают так же, как и помещение бокса. Через 45-60 минут после обработки в бокс вносят все необходимые для работы материалы, инструменты, кроме образцов изделия.

Перед внесением материалов в настольном боксе включают вентиляцию на время, достаточное для обеспечения полного обмена воздуха в нем.

За 1,5-2 часа до начала работы в боксе и предбокснике на 1-1,5 часа включают бактерицидные лампы.

Инструменты, посуду и спецодежду, используемые в работе, предварительно стерилизуют в паровом стерилизаторе. Металлические, стеклянные и тканевые изделия обрабатывают при следующем режиме: температура 132+-2°С, время стерилизационной выдержки 20 минут; изделия из резины (перчатки и т.д.) - при температуре 120+2°С в течение 45 минут.

Перед входом в бокс работники лаборатории тщательно моют руки теплой водой с мылом и щеткой, вытирают стерильным полотенцем, надевают в предбокснике на ноги бахилы, стерильные халаты, 4-слойные маски, шапочки, на руки - стерильные перчатки.

В процессе посева в боксе регулярно проверяют обсемененность воздуха. Для этого на рабочий стол ставят 2 чашки с питательным агаром, открывая их на 15 минут, затем чашки помещают в термостат при температуре 37°С на 48 часов. Допускается рост не более трех колоний неспорообразующих сапрофитов.

В случае роста на чашках более 3 колоний проведение дальнейших работ в данном боксе запрещается, в нем дополнительно проводят тщательную обработку 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющих средств.

Приготовление растворов комплекса перекиси водорода с моющими средствами Триас-А, Астра, Лотос проводят в соответствии с расчетом, приведенным в таблице.

Состав рабочего раствора		Количество пергидроля, воды, моющего средства, необходимое для приготовления 1 л раствора
Концентрация		Пергидроля в зависимости от концентрации в нем перекиси водорода		Воды, мл	Моющего средства, г
перекиси водорода	моющего средства	концентрация перекиси водорода в пергидроле	количество пергидроля в мл на 1 л раствора
3,0	0,5	30,0	100,0	895
		31,0	97	898
		32,0	94	901	5
		33,0	90	905
6,0	0,5	30,0	200	795
		31,0	194	801
		32,0	188	807	5
		33,0	180	815

При приготовлении раствора пергидроль приливают к раствору моющего средства.

При приготовлении растворов перекиси водорода и работе с 6% растворами руки защищают резиновыми перчатками, а глаза - герметичными очками. При попадании пергидроля на кожу или в глаза их немедленно промывают обильным количеством водопроводной воды. При несоблюдении указанных правил техники безопасности могут развиваться дерматиты и конъюнктивиты. Запасы препарата хранят в местах, недоступных для общего пользования, в темной посуде, желательно, при температуре +4°С.

3. Методика приготовления биотестов включает следующие этапы: подготовку тест-культуры, подготовку носителей (изготовление, мойка, стерилизация), обсеменение и высушивание носителей, упаковка биотестов, определение фактической плотности обсеменения носителей, контроль устойчивости тест-культуры на носителе, хранение приготовленных биотестов.

4. Тест-культуры Bacillus stearothermophilus BKM В-718 (контроль работы паровых стерилизаторов) и Bacillus licheniformis штамм G (контроль воздушных стерилизаторов) хранятся в музее культур ВНИИ профилактической токсикологии и дезинфекции МЗ СССР.

Адрес института: 117246, г. Москва, Научный проезд, д. 18.

5. Согласно "Положению о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения" МЗ СССР, 1980 г., отпуск тест-культур производится по официальному требованию за подписью руководителя учреждения, скрепленному печатью учреждения, запрашивающего тест-культуру.

6. Биотесты приготавливают партиями. Партией считают определенное количество биотестов, приготовленных из исходной культуры в условиях производства, считающихся одинаковыми (получение спор на одной партии питательной среды, одновременное высушивание носителей и т.д.).

7. Методика приготовления питательных сред для получения спор тест-культур изложена в прил. 6.

8. Биотесты, используемые для контроля работы паровых и воздушных стерилизаторов, должны иметь стандартизированные показатели устойчивости тест-культур: время выживания тест-культур на носителе.

8.1. Устойчивость тест-культур должна быть воспроизводимой характеристикой от даты приготовления до истечения срока годности биотеста.

8.2. Каждую приготовленную партию биотестов проверяют соответственно на устойчивость тест-культур на носителе к водяному насыщенному пару под избыточным давлением (прил. 6, п. 19) или сухому горячему воздуху (прил. 7, п. 19).

8.2.1. Из каждой партии биотестов методом случайной выборки отбирают две группы биотестов в количестве не менее 10 образцов каждая.

8.2.2. Для определения показателей устойчивости одну группу биотестов подвергают действию стерилизующего агента на соответствие показателю времени выживания спор тест-культуры на 100% исследуемых носителей, другую - времени гибели спор тест-культуры на 100% исследуемых носителей.

8.2.3. При получении неудовлетворительных результатов испытаний биотестов (п. 8.2) проводят повторный контроль удвоенного количества биотестов от той же партии. Результаты повторных испытаний распространяют на всю партию.

8.3. Показатели устойчивости тест-культур в соответствии с прил. 6, п. 19 (7, п. 19) обеспечивают надежный контроль работы паровых и воздушных стерилизаторов на режимы стерилизации изделий медицинского назначения.

9. Биотесты маркируют. Маркировка включает следующие данные: наименование тест-культуры; метод стерилизации, который подлежит контролю; номер партии; число спор на носителе; показатели устойчивости тест-культур; срок годности; условия хранения; наименование организации-изготовителя.

К наборам биотестов следует прилагать методику культивирования тест-культур после стерилизации и методику обеззараживания инфицированного материала.

10. Биотесты хранят при комнатной температуре. Срок хранения 2 года от даты изготовления. По истечении этого срока проводят повторно контроль устойчивости.

11. Для культивирования тест-культур после определения устойчивости к соответствующему стерилизующему агенту (прил. 6, 7 п. 19) и после бактериологического контроля работы стерилизаторов (раздел 4) в бактериологической лаборатории с соблюдением правил асептических условий биотесты вынимают из упаковки. Во флаконы вносят 1 мл питательной среды и закрывают стерильными резиновыми пробками (N 7, 5) с целью предупреждения высыхания питательной среды (в случае отсутствия резиновых пробок во флаконы вносят 5 мл питательной среды и закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками), диски из фильтровальной бумаги и чашечки из фольги пинцетом, который обжигают в пламени, помещают в бактериологические пробирки с 5 мл питательной среды.

12. Методика приготовления питательных сред для культивирования тест-культур после стерилизации изложена в прил. 6.

13. Учет результатов бактериологического контроля проводят путем ежедневного визуального осмотра всех биотестов с питательной средой:

13.1. при использовании бульона Хоттингера, питательного бульона сухого, мясопептонного бульона, бульона из перевара кровяных сгустков, сухой питательной среды для контроля стерильности рост тест-культур определяют по помутнению питательной среды;

13.2. при использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культур определяют по изменению красного цвета среды (рН 7,7+-0,1) на желто-оранжевый (рН 6,7+-0,1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты, под действием которой происходит изменение цвета индикатора. При использовании этой питательной среды необходимо обязательно использовать резиновые пробки (стерильные). Флаконы или бактериологические пробирки должны быть плотно закрыты резиновыми пробками (N 7,5 и N 12,5 соответственно) с целью предупреждения ложного отрицательного результата (при наличии роста культуры отсутствует изменение цвета питательной среды - это происходит в результате улетучивания углекислого газа, образующегося при разложении глюкозы).

Биотесты считают стерильными, если помутнение (изменение цвета) питательной среды отсутствует, что указывает на гибель спор тест-культуры, т.е. на эффективность работы стерилизатора.

Предварительное заключение о неудовлетворительном результате контроля делают по помутнению (изменению цвета) питательной среды.

14. Окончательный ответ выдают после высева из пробирок (флаконов) с признаками роста и сравнения выделенной культуры с контролем. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения.

15. В качестве контроля используют биотест, который не подвергают действию стерилизующего агента, и питательную среду, которую применяют для культивирования тест-культур после стерилизации. Контрольные тесты культивируют аналогично биотестам, которые подвергали действию стерилизующего агента.

16. При отсутствии роста тест-культур в контрольном биотесте, который не подвергали действию стерилизующего агента, устанавливают причины (нежизнеспособность тест-культуры, нарушение методики приготовления биотестов, питательных сред, культивирования). Результаты бактериологического исследования аннулируют и повторяют контроль работы аппарата.

17. После регистрации результатов бактериологического исследования лабораторную посуду (чашки Петри, пробирки, пипетки), пробки, посевы обеззараживают в паровых стерилизаторах под давлением при температуре (126+-2)°С (0,15 МПа (1,5 кгс/см2), время выдержки 120 минут.

18. При обнаружении неудовлетворительных результатов бактериологического контроля работы стерилизатора бактериологическая лаборатория извещает об этом по телефону руководителя медицинского учреждения и направляет заключение о результате бактериологического контроля.