Глава 4. Методы определения пищевых добавок в составе БАД

Глава 4.
Методы определения пищевых добавок в составе БАД

I. Метод определения консервантов (бензойная и сорбиновая кислоты) с помощью ВЭЖХ

Сущность метода

Метод основан на извлечении бензойной кислоты (БК) и сорбиновой кислоты (СК) из БАД перегонкой с паром и/или экстракцией органическим растворителем с последующим хроматографическим разделением их в тонком слое сорбента, элюции и измерении оптической плотности полученных элюатов.

Подготовка к испытанию

Приготовление стандартных растворов

Раствор 1. Навеску 100 мг бензойной кислоты переносят в мерную колбу на 25 см3 и доводят до метки этилацетатом (концентрация полученного раствора 4 мг/см3).

Раствор 2. Навеску 40 мг сорбиновой кислоты переносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки этилацетатом (концентрация полученного раствора 0,4 мг/см3).

Раствор 3. Смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Концентрация БК в полученном растворе 2,0 мг/см3, СК - 0,2 мг/см3.

Выделение бензойной и сорбиновой кислот

Анализируемую пробу продукта (кроме напитков) массой около 10 г отвешивают с точностью до 0,01 г, измельчают и гомогенизируют с добавкой 25 г Na2SO4 и 40 см3 1 М H2SO4. Гомогенат переносят в колбу емкостью 1 дм3, соединенную с парообразователем и нагревают (рис. 25).

В момент, когда жидкость в колбе начинает закипать, закрывают парообразователь пробкой и отгоняют БК и СК с паром, собирая около 80 см3 дистиллята в приемник, содержащий 10 см3 1 М NaOH. Дистиллят переносят в делительную воронку, насыщают Na2SO4 (на 10 см3 дистиллята добавляют 6 г Na2SO4), подкисляют 1 М H2SO4 до pH 2,0-3,0 и экстрагируют этилацетатом трижды по 10 см3. Объединенный экстракт сушат, добавляя 2 г прокаленного безводного Na2SO4. Этот экстракт обозначают V_1. Экстракт упаривают на ротационном испарителе (допускается упаривание в фарфоровой чашке на песчаной бане) до объема 1 см3.

При анализе напитков исключают стадию отгонки, 10 см3 напитка разбавляют вдвое 0,5М H2SO4, добавляя 10 г Na2SO4, интенсивно перемешивают и экстрагируют БК и СК 3 раза по 5 см3 этилацетатом. Объединенный экстракт (V_1) сушат 1 г безводного прокаленного Na2SO4. Экстракт упаривают на ротационном испарителе или в фарфоровой чашке до конечного объема 1 см3.

Количественне определение с помощью ВЭЖХ согласно ГОСТ Р 30059-93 "Напитки безалкогольные. Методы определения аспартама, сахарина, кофеина и бензоата натрия".

Хроматографический анализ

Аппаратура, материалы

Жидкостной хроматограф с УФ детектором, длина волны 272 нм.

Автоматическая система обработки данных типа "Амперсент" или интегратор

Колонка "Kromasil 5мю С 18", размер колонки 250 х 4.6 мм, размер частиц 5 мкм.

Полученный экстракт и раствор стандарта 3 поочередно вводят в жидкостный хроматограф при следующих условиях работы: состав элюэнта 0,025 М ацетат натрия, pH 4,5-ацетонитрил (8:2), скорость подвижной фазы 1,0 см3/мин, детектирование в УФ-спектре при 272 нм, объем вводимой пробы 5-10 мкл, чувствительность детектора 0,01 О.Е.П.

На хроматограмме экстракта идентифицируют пики БК и СК по времени удерживания стандартов: для БК - 3,4 мин +-0,2, для СК - 4,4 +-0,2 мин

Для подтверждения правильности идентификации консервантов аликвоты раствора 3 и экстракта вводят в хроматограф в тех же условиях повторно, регистрируя в максимумах хроматографических пиков спектр поглощения БК (250-270 нм) и СК (230-270 нм). БК имеет три максимума поглощения в указанном интервале спектра - 268, 270 и 272 нм, а СК - один - 254 нм, что является дополнительным идентификационным признаком для подтверждения присутствия их в образце.

Обработка результатов

Измеряют высоту пиков стандартов БК и СК на хроматограммах и рассчитывают их содержание в мг/кг или мг/дм3 по формуле:

                                 Р х Н  x V

                                      0    1

                 С = 1000 х К х -------------, где

                                   H   x М

                                    ст

     К   - коэффициент, учитывающий степень извлечения БК и СК;

     Р   - концентрация   БК   или СК в растворе  стандарта  (раствор 3),

           мг/см3;

     Н   - высота пика БК или СК на хроматограмме экстракта, мм;

      0

     Н   - высота пика БК или СК на хроматограмме стандартов, мм;

      ст

     V   - объем экстракта, см3;

      1

     М   - масса образца, взятая для анализа (г) или объем напитка (см3).

Вычисление проводят до второго десятичного знака.

За конечный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 44.

Таблица 44

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

Содержание, мг/кг	Бензойная кислота		Сорбиновая кислота
	Rr, %	RR, %	Rr, %	RR, %
150-300	15	30	15	30
300-2000	15	25	15	25

II. Метод определения заменителей сахара

Идентификация и количественное определение осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1. Метод определения аспартама

Аспартам: 1-Метиловый эфир N-L-а-аспартил-L-фенилаланина.

Условия ВЭЖХ

Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм. Сорбент-Кромасил 100 С18, зернение 5 мкм. Перед работой новую колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы. Для этого колонку промывают 40 см3 изопропанола, затем 80 см3 деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Подвижная фаза

5,6 г фосфорнокислого калия однозамещенного, безводного (КН2РО4) растворяют в 820 см3 бидистиллированной воды, доводят pH до 4,3 добавлением фосфорной кислоты, после чего прибавляют 180 см3 ацетонитрила. Смесь дегазируют на роторном испарителе.

Стандарт аспартама с концентрацией 1 мг/см3.

Детектирование

Спектрофотометр, длина волны УФ 255 нм, шкала 0.5 AUFS, скорость потока 0.8 см3/мин., время удерживания аспартама - 6,2 +-0,05 мин. Обработка хроматографических данных по программе МультиХром для Windows версия 1.39.

Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +-5%.

2. Метод определения дикетопиперазина

Дикетопиперазин: 5-Бензил-3,6-диокси-2-пиперазилуксусная кислота.

Подготовка образца

При определении аспартама и дикетопиперазина в БАД учитывают неустойчивость аспартама к нагреванию, а также то, что он гидролизуется в сильнокислых и нейтрально-щелочных средах.

Проведение анализа

Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ - по методу 1.

Детектирование: УФ 210нм, шкала 0.01 AUFS, скорость потока 0.8 см3/мин, стандартный раствор 2 мкг/см3, время удерживания дикетопиперазина 3,9 +- 0,02. Ошибка метода +-2%.

3. Метод определения ацесульфама К

Ацесульфам: 6-метил-1,2,3-оксатиазин-4(3H)-он-2,2-диоксид, калиевая соль.

Проведение анализа

Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ - по методу 1. Детектирование: УФ 225 нм, шкала 0.05 AUFS, время удерживания 2,8 +- 0,02.

4. Метод определения сахарина

Сахарин: 3-оксо-2,3-дигидробензо[d]изотиазол-1,1-диоксид.

Подготовка образца

При выделении из БАД учитывают следующие свойства сахарина: 1 г сахарина растворяется в 290 см3 холодной воды или в 25 см3 кипящей воды, в 31 см3 этилового спирта и в 12 см3 ацетона. Сахарин практически нерастворим в хлороформе, хорошо экстрагируется этиловым и петролейным эфирами. Растворимость его увеличивается при добавлении лимонной, винной или уксусной кислот. Он устойчив при нагревании до 150°C при pH 3.3 и 7,0.

Проведение анализа

Подготовка хроматографической колонки и условия ВЭЖХ - по методу 1. Детектирование: УФ 269 нм, шкала 0.1 AUFS, время удерживания 2,9 +- 0,1 мин.

5. Метод определения цикламата и цикламата в смеси с сахарином

Цикламат: натриевая соль циклогексиламино-N-сульфоновой кислоты.

Условия ВЭЖХ

Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм. Сорбент-Кромасил 100 С18, зернение 5 мкм. Перед работой новую колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы согласно описанию в методе 1.

Подвижная фаза

5,6 г фосфорнокислого калия однозамещенного, безводного (КН2РО4) растворяют в 850 см3 бидистиллированной воды, доводят pH до 1,8 добавлением фосфорной кислоты, после чего прибавляют 150 см3 ацетонитрила. Смесь дегазируют на роторном испарителе.

Детектирование

Спектрофотометр, длина волны УФ 210 нм, шкала 0.02 AUFS, скорость потока 0,6 см3/мин, время удерживания цикламата - 7,1 +- 0,02 мин, сахарина - 8,5 +- 0,05 мин.

Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода +-5%.

6. Метод определения сукралозы

Сукралоза: 1,6-дихлор-1,6-дидеокси-бета-D-фруктофуранозил-4-деокси-альфа-D-галактопи ранозид; 4,1(1), 6(1)-трихлоргалактосахароза.

Условия ВЭЖХ

Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4,6 мм. Сорбент: сепарон SGX С18, зернение 7 мкм. Перед работой новую колонку необходимо перевести на обратнофазный режим работы согласно описанию в методе 1.

Подвижная фаза

Ацетонитрил - вода (15:85).

Стандарт концентрацией 1,0 мг/см3. Стандартный раствор готовят в подвижной фазе.

Детектирование: рефрактометр, скорость потока 0,7 см3/мин, время удерживания сукралозы - 6,5 +- 0,05 мин. Ошибка метода +-5%.

7. Метод определения изомальта

Пищевая добавка, заменитель сахара Е 953 изомальт - дисахаридный полиол, состоящий из смеси примерно равных частей D-глюкопиранозил-1,6-D-сорбита (GPS) и D-глюкопиранозил-1,1-D-маннита (GPM). Брутто формула С12Н24О11.

Принципиальная схема метода

Метод заключается в количественном определении основных компонентов изомальта (GPS и GPM) или суммы их концентраций и предусмотренных спецификацией примесей сорбита, маннита, изомальтулозы, а также глюкозы, фруктозы и сахарозы в исследуемом экстракте с помощью катионообменной ВЭЖХ в форме Са++ при температуре хроматографической колонки 80°C или с помощью ВЭЖХ на аминофазе с использованием рефрактометрического детектора.

Материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0.1 до 5 см3/мин. с устройством для термостатирования колонки

Колонка и предколонка с катионитом в форме Са++ "НРХ-87 С, BioRad" или аналогичная колонка и предколонка на основе сульфированного стиролдивинилбензола в ионной кальциевой форме (8%), например, "Rezex RCU-USP Sugar Alcohols" или "Waters Sugar-Pak", длина колонки 250 мм, предколонки - 30 мм, внутренний диаметр колонки и предколонки 4,0 или 4,6 мм;

Колонка и предколонка Kromasil NH2 (MetaChem Technologies, США) или аналогичная, параметры колонки 250 х 4,6 мм, размер частиц сорбента 5 мкм;

Рефрактометрический детектор; например, MERK L 7490, Германия, регистрирующий потенциометр (самописец) или интегратор или автоматическая система обработки данных "МультиХром для Windows 9x&NT", версия 1,5х;

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с допустимой погрешностью +-0,01 г;

Весы лабораторные общего назначения с допустимой погрешностью +-0,001 г.;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии;

Вакуум-сушилка;

Эксикатор;

Термометр ртутный стеклянный лабораторный на 200°C по ГОСТ 215-73;

Изомальт фирмы Sudzucker, LIMS No 200009040;

Фруктоза, глюкоза, сорбит, маннит, сахароза, изомальтоза кристаллические;

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78;

Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC;

Вода бидистиллированная деионизированная по ГОСТ 6709 и фильтрованная через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC;

Шкаф сушильный, обеспечивающий нагрев до 150°C;

Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ;

Бюкса с притертой крышкой по ГОСТ 7148-70;

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 7148-70 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100 и 250 см3;

Цинк уксуснокислый 2-водный, х. ч. по ГОСТ 5823-78; раствор концентрацией 300 г/дм3.

Приготовление стандартных растворов

Аналитический образец изомальта высушивают до постоянного веса согласно ГОСТ 12570-67 "Сахар-песок и сахар-рафинад. Метод определения содержания влаги". Готовят стандартный раствор изомальта с массовой концентрацией 3 мг/см. Точные концентрации GPS и GPM в полученном стандартном растворе рассчитывают, исходя из навески изомальта и количеств каждого компонента смеси, декларированных в аналитическом сертификате. Таким образом, концентрации GPS и GPM должны составить от 1,4 до 1,6 мг/см3.

Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы, сорбита, маннита, сахарозы, изомальтулозы с массовыми долями 3 мг/см.

Приготовление исследуемого образца

Анализируемый образец БАД или пищевого продукта размельчают или растирают в ступке. Навеску массой 5 +-0,01 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 150 см3 подогретой до 75-80°C дистиллированной воды и встряхивают на аппарате для встряхивания 20-30 минут. Доводят температуру смеси до комнатной, переносят в делительную воронку, встряхивают с хлороформом (3 раза по 50 см3), хлороформный слой отбрасывают, верхний водный слой количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3. Добавляют 15 см3 30%-ного раствора ацетата цинка, встряхивают, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или складчатый бумажный фильтр "синяя лента". Остаток хлороформа из фильтрата отдувают в токе азота и аликвоту вводят в хроматограф.

Анализ с помощью ВЭЖХ

I вариант (с использованием катионообменной ВЭЖХ).

Условия ВЭЖХ: температура 80-90°C, подвижная фаза бидистиллированная, деионизированная и фильтрованная вода, скорость подвижной фазы 0,4-0,8 см3/мин., аликвота, вводимая в инжектор 10-15 мкл; чувствительность рефрактометрического детектора устанавливается таким образом, чтобы ввод 1,5 мкг GPS или GPM соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Определяют каждый компонент изомальта (GPS и GPM) и суммируют их.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании катионообменной ВЭЖХ (зависят от типа колонки, скорости подвижной фазы и температуры колонки): сахароза - 9+-1, изомальтулоза - 10+-1, глюкоза - 12 +-2, GPM - 14 +-1, фруктоза - 15 +-1, GPS - 16 +-1, маннит - 22 +-2, сорбит - 29 +-2.

II вариант (с использование аминофазы).

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил-вода (77:23), скорость подвижной фазы 1,0 см3/мин., аликвота, вводимая в инжектор 10-15 мкл; чувствительность рефрактометрического детектора устанавливают таким образом, чтобы ввод 30 мкг фруктозы, глюкозы или сахарозы соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3% от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Определяют сумму концентраций (GPS и GPM) в виде изомальта.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании амино-фазы: фруктоза - 7,0 +-0,2, сорбит 7,5 +-0,2, глюкоза 8,5 +-0,1, сахароза 11 +-0,1, изомальт 13 +-0,2.

Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения метода по манниту, сорбиту и изомальтулозы - около 30,0 мг/дм3 или 0,003%. Стандартное отклонение сходимости (Sr) при концентрации сорбита 1% не превышает 0,1-0,13. Среднее значение открываемости маннита, сорбита и изомальтулозы 91-95%, GPS и GPM - 96-98%.

Метод позволяет определять содержание GPS, GPM или изомальта, а также концентрации примеси глюкозы, фруктозы, сорбита, маннита, сахарозы и изомальтозы.

Обработка результатов измерений

Количественное определение компонентов осуществляют методом внешнего стандарта. Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,005, 0,01 и 0,02 см3 соответствующих стандартных растворов. Для каждого количества определяют площадь пика на хроматограмме.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 см3 (10 мкл) раствора анализируемого образца. Определяют площадь пика, соответствующего по времени удерживания стандартам. Расчет концентрации компонентов проводят по формуле:

                         V  x m x S

                          1        обр.

                 С = ----------------------, % где

                      V  х M x S   x l0000

                       2        ст.

     С     - концентрация компонента в образце, %;

     V     - объем анализируемого образца, см3 (250 см3);

      1

     V     - объем аликвоты раствора анализируемого образца, внесенный в

      2      хроматограф, (0,01 см3);

     m     - масса  стандарта, введенного  в хроматограф при калибровке,

             мкг;

     М     - навеска образца, взятая для анализа, г;

     S     - площадь пика в анализируемом образце;

      oбp.

     S     - площадь пика стандарта.

      ст

III. Методы определения состава ароматизаторов

Состав и содержание ароматизаторов определяют методом хромато-масс-спектрометрии (ХМС). Если допускает состав пробы, ХМС-анализ проводят по следующим схемам:.

а) прямой ХМС анализ исходного образца;

б) ХМС анализ экстракта.

Приборы

Хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки данных и библиотекой масс-спектров.

Подготовка пробы

Органические компоненты экстрагируют из образца, разбавленного водой в соотношении 1:5, смесью эфир-пентан (5x3 см3); если растворитель - пропиленгликоль, экстракцию проводят пентаном. Экстракт обезвоживают сульфатом натрия и упаривают в токе азота при комнатной температуре до 100 мкл, 1 мкл экстракта вводят в инжектор.

Условия хроматографического разделения

Кварцевая капиллярная колонка длиной 30-50 м, внутренним диаметром 0,2-0,23 мм, неподвижная фаза полиметилсилоксан типа SE 30, толщина пленки 0,2-0,3 мкм, газ-носитель гелий, давление на входе колонки 1,6 атм. Температура источника ионов 160°C, испарителя и переходных линий 220 и 200°C, режим программирования температуры колонки: 50°C (2 мин), 120°C (5 мин), далее - повышение температуры за 4 мин до 250°C, изотерма - 20 мин.

Условия масс-спектрометрии: энергия ионизирующих электронов 70 eV, сканирование по ПИТ от 39 до 450 а. е. м., обработка данных с использованием библиотек масс-спектров для идентификации отдельных ароматических компонентов (http://www.nysaes.cornell.edu/fst/faculty/acree/flavornet/OV101.html).

Список разрешенных ароматизаторов приведен в СанПиН 2.3.2.1293-03 "Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования по применению пищевых добавок".

IV. Метод определения синтетических пищевых красителей

К синтетическим пищевым красителям относятся органические соединения следующих групп: азокрасители, пиразолоновые, трифенилметановые, антрахиноновые, индигоидные, ксантеновые, хинолиновые и полициклические (Е102 - "Тартразин", Е103 - "Алканет", Е104 - "Желтый хинолиновый", Е107 - Желтый 2G, Е110 - "Желтый солнечный закат", Е122 - "Азорубин, Кармуазин", Е124 - "Понсо 4R", Е128 - "Красный 2G", Е129 - "Красный очаровательный AC", E131 - "Синий патентованный FCF", E142 - "Зеленый S", E143 - "Зеленый прочный FCF", E151 - "Черный блестящий PN", E155 - "Коричневый NT").

В зависимости от типов заместителей растворимость в воде рассматриваемых красителей колеблется от очень хорошей до очень плохой. Увеличение числа сульфатных или карбоксильных групп повышает растворимость в воде. Наличие заместителей (хлор, нитрогруппа или метил) повышает растворимость красителей в органических растворителях. В настоящей методике органические красители разделены на несколько групп в соответствии с их химическим строением: азокрасители, пиразолоновые, трифенилметановые, антрахиноновые, индигоидные, ксантеновые, хинолиновые и полициклические.

Таблица 45

Перечень и свойства синтетических пищевых красителей

Краситель	Номер пo CI	Индекс FD&C	Макс. поглощения, нм	Коэффициент светопоглощения эталона (Э)
1	2	3	4	5
Тартразин Е102	19140	FD&C Yellow 5	427	0,053
Алканет Е103	14270	-	425	0,064
Хинолиновый желтый Е104	47005	Food Yellow 13	412	0,096
Желтый "Солнечный закат" Е110	15985	Food yellow 6	484	0,054
Кармины E120	75470	Natural Red 4
Азорубин E122	14720	Food Red 3	228	0,045
Амарант E123	16189	Food Red 9	521
Понсо 4R E124	14700	-	502	0,054
Эритрозин E127	45430	FD&C Red 3	525	0,057
Красный 2G E128	18050	Food Red 10
Красный "Очаровательный" E129	16035	-	500	0,052
Патентованный синий Е131"	42051	-	639	0,048
Индигокармин Е132	73015	FD&C Blue 2	610	0,048
Синий блестящий FCF Е133	42090	FD&C Blue 2	630	0,164

1. Определение качественного состава красителей в БАД методом ТСХ

1.1. Качественное определение индивидуальных и смесевых синтетических пищевых красителей

Качественный состав индивидуальных и смесевых пищевых красителей (СПК) определяют методом ТСХ на силикагеле в системах:

         Система А

                   н-пропанол                               100 мл

                   этилацетат                                30 мл

                   вода                                      30 мл

                   аммиак                                     1 мл

         Система В

                   уксусная кислота                          20 мл

                   изобутанол                                50 мл

                   вода                                      20 мл

Наносят на пластинку ТСХ 2-5 мкл раствора исследуемого образца с концентрацией 10 мг/100 см3. Проводят разделение в системе А.

Таблица 46

Величины Rf некоторых СПК при ТСХ

Наименование красителя	Величина Rf (система А)	Величина Rf (система В)
1	2	3
Тартразин Е102	0,595	0,19
Желтый хинолиновый Е104		0,56
Желтый "Солнечный закат" Е110	0,690	0,57
Кармуазин Е122	0,78	0,51
Понсо 4R E124	0,571	0,51
Эритрозин E127		0,97
Красный "Очаровательный" E129		-
Синий патентованный Е131		0,5
Индигокармин Е132	0,714	0,26
Синий блестящий FCF E133		0,5
Зеленый S E142	0,571	0,35
Зеленый прочный FCF E143		0,18

В случае, если в системе А смеси пищевых красителей не разделились, либо величины Rf пищевых красителей, находящихся в смеси, близки проводят хроматографическое разделение в системе В, либо двумерную ТСХ, используя в качестве второй подвижной фазы систему В.

1.1.1. Очистка образца

В случае, если в матриксе пищевого красителя присутствуют вещества препятствующие нанесению на пластинку ТСХ либо способствующие необратимой сорбции образца пищевого красителя на старте, необходимо провести предварительную очистку образца. Дня этого на стеклянный фильтр диаметром 25-30 мм помещают целлюлозу в виде суспензии в 25%-ном растворе сульфата аммония слоем толщиной около 5 мм. На слой целлюлозы наносят очищаемый образец и производят элюирование поэтапно: метанолом (20 см3) и 25%-ным раствором сульфата аммония (80 см3) до исчезновения окраски целлюлозы. Полученный элюат используют для проведения анализа методом ТСХ.

1.1.2. Очистка образца хроматографическими методами

10-20 г порошка целлюлозы перемешивают примерно с 200 см3 воды. Дают смеси отстояться и декантируют жидкость. Повторяют промывку и декантацию. К промытой целлюлозе добавляют приблизительно 100 см3 элюента, перемешивают и переносят суспензию в хроматографическую колонку. После стекания жидкости промывают содержимое колонки еще 100 см3 элюента. 5 г целлюлозы промывают, как описано выше. К промытой целлюлозе добавляют 100 см3 элюента, перемешивают, дают смеси отстояться и отделяют жидкость декантацией.

Соединяют 5 г промытой целлюлозы с образцом красителя, добавляют 10 г сульфата аммония. Тщательно перемешивают. Количественно переносят смесь в колонку. Для ополаскивания используют приблизительно 25 см3 элюента. Когда весь раствор стечет, добавляют около 400 см3 элюента. Собирают восемь фракций по 50 см3 каждая и анализируют с помощью ТСХ.

1.2. Количественное определение состава синтетических пищевых красителей в БАД с помощью ТСХ и спектрофотометрии

1.2.1. Обработка образца

Водорастворимые БАД

Твердый образец

Навеску 5,0 г образца и переносят в плоскодонную колбу вместимостью 250 см3. Добавляют примерно 50 см3 кипящей воды и встряхивают до полного растворения образца. Переносят окрашенные соединения на полиамидный порошок согласно п. 1.2.2.

Жидкий образец

Отбирают 50,0 см3 образца и переносят окрашенные соединения на полиамидный порошок согласно п. 1.2.2.

БАД с высоким содержанием жира

Обезжиривают образец при помощи петролейного эфира. Навеску 5,0 г переносят в центрифужную пробирку. Добавляют приблизительно 20 см3 петролейного эфира и перемешивают при помощи стеклянной палочки. Декантируют петролейный эфир. Повторяют до полного обезжиривания. Если образец не содержит жира, его переносят в плоскодонную колбу вместимостью 250 см3, добавляют 50 см3 кипящей воды и далее действовуют согласно п. 1.2.2.

БАД с высоким содержанием крахмала и белка

Навеску 5,0 г БАД переносят в центрифужную пробирку. Добавляют 25 см3 кипящей воды и перемешивают. Добавляют 25 см3 смеси метанол-5%-ный аммиак 95:5. Проверяют pH (величина pH должна составлять приблизительно 9). Тщательно перемешивают. Оставляют образец в холодильнике примерно на 15 мин. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Декантируют чистый раствор в плоскодонную колбу емкостью 250 см3. Добавляют 5 см3 воды в центрифужную пробирку, перемешивают и добавляют 10 см3 смеси метанол-25%-ный аммиак 95:5. Перемешивают и центрифугируют, как описано выше. Повторяют указанную процедуру до полной экстракции окрашенных соединений. Объединяют все экстракты. Упаривают объединенный экстракт на водяной бане приблизительно до объема 25 см3 (чтобы удалить весь метанол). Добавляют 25 см3 воды и нагревают раствор. Далее действовуют согласно п. 1.2.2.

1.2.2. Перевод красителей на полиамидный порошок

Используя раствор уксусной кислоты в метаноле (1:1 по объему) или водный аммиак доводят pH образца до 4-5. Добавляют 1 г полиамидного порошка к теплому раствору. Перемешивают в течение 1 минуты. Дают порошку осесть. Проверяют исчезновение окраски раствора. Если окраска сохранилась, добавляют еще некоторое количество полиамидного порошка и перемешивают. (Синтетические красители полностью абсорбируются на полиамиде, натуральные красители - лишь частично. Свойство красителей абсорбироваться на полиамидной матрице можно использовать для определения наличия натурального красителя в образце). Полиамидный порошок: SC6 "Machery Nagel & Со" Duren, размер пор 0,05 - 0,16 мм.

Перемешивают и переносят суспензию на стеклянную колонку. Промывают плоскодонную колбу тремя порциями по 10 см3 горячей воды и переносят на колонку. Колонку промывают 10 см3 горячей воды и затем 3x5 см3 метанола. Стеклянная колонка: длина 20 см, внутренний диаметр - 30 мм.

1.2.3. Элюирование и концентрирование индивидуальных красителей

Помещают круглодонную колбу вместимостью 100 см3 под колонку и элюируют красители с полиамида растворителем (метанол-25%-ный аммиак 95:5 по объему) порциями по 5 мл со скоростью 2 мл/мин до тех пор, пока полиамид не обесцветится. Упаривают элюат досуха на вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°C. Добавляют 1-2 см3 смеси метанол-25%-ный аммиак 95:5. Используют полученный раствор для разделения красителей методом ТСХ.

1.2.4. Разделение методом ТСХ

Используя микрошприц или микропипетку, наносят на хроматографическую пластинку (целлюлоза, толщина слоя 0,10 мм, DC-Fertigplatten, Merck Art 5716 без флуоресцентного индикатора) полосу образца, полученного по п. 1.2.3 длиной около 3 см. Объем пробы 50-100 мкл. Высушивают нанесенный образец феном.

ТСХ проводят в одной из трех систем растворителей:

2,5%-ный водный раствор цитрата натрия (С6Н5Na3O7 х 2Н2О) - 25%-ный аммиак - метанол, 80:20:12 (по объему)

1-пропанол - этилацетат - вода, 6:1:3 (по объему)

трет-бутанол - пропионовая кислота - вода, 50:12:38 (по объему)

Соскабливают разделившиеся окрашенные зоны с пластинки в различные центрифужные пробирки. Доводят аммиаком pH растворов до 7. Добавляют по 5 или 10 см3 воды, закрывают пробками и встряхивают в течение 1 мин. Удаляют пробки и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Декантируют супернатант в другие центрифужные пробирки и повторяют центрифугирование.

1.2.5. Количественное определение

Определяют поглощение чистых растворов на спектрофотометре при характерных для каждого красителя длинах волн максимума поглощения. Для контроля чистоты красителя и подтверждения структуры красителя снимают спектр образца и сравнивают со спектром стандартного раствора или библиотечным спектром.

1.2.5.1. Расчет содержания основного вещества в красителях

Содержание основного вещества X, определенное спектрофотометрически, рассчитывают по формуле:

                            F x l00 x V

                       Х = ---------------, где

                            Э x l000 x g

     D - оптическая плотность исследуемого раствора;

     V - объем, см3;

     Э - коэффициент светопоглощения эталона настоящей методики;

     g - масса, мг.

2. Определение синтетических пищевых красителей методом ВЭЖХ

2.1. Условия ОФ ВЭЖХ

Колонка: Kromasil С18, 5 мю м, 250 х 4,6 мм ID.

Элюент: 10 мМ фосфатный буфер, pH 4.2 - ацетонитрил, 80:20 об.%.

Скорость подачи элюента: 1 см3/мин.

Детектирование: UV-Vis 500 нм (красные), 450 нм (желтые) и 600 нм (синие СПК).

2.2. Условия ион-парной ОФ ВЭЖХ

Колонка: Kromasil С18, 5 мю м, 250 х 4,6 мм ID

Элюент: 10 мМ тетрабутиламмоний фосфат, 10 мМ фосфатный буфер, pH 4,2 - ацетонитрил, 55:45 об.%.

Скорость подачи элюента: 0,9 см3/мин.

Детектирование: UV-Vis 500 нм (красные), 450 нм (желтые) и 600 нм (синие СПК).

2.3. Подготовка стандартных растворов

Стандартные растворы синтетических пищевых красителей готовят путем растворения точных навесок СПК с известной концентрацией основного вещества в мерных колбах дистиллированной водой. Эритрозин (Е 127) растворяют в метаноле. Градуировочные графики строят в координатах S (площадь пика) - С (концентрация СПК), г/л в интервале концентраций 0,002-0,01 г/л.

2.4. Пробоподготовка

Соки и сокосодержащие БАД (10 см3) разбавляют дистиллированной водой в колбе объемом 100 см3, пробы фильтруют через мембранный фильтр с диамертом пор 0,2 мкм. Концентраты соков (10 г) разбавляют дистиллированной водой в колбе объемом 250 см3, пробы фильтруют через мембранный фильтр с диамертом пор 0,2 мкм.