Приложение 11 (обязательное). 11. Определение протективной активности вакцинного штамма холерного вибриона

Приложение 11
(обязательное)

11. Определение протективной активности вакцинного штамма холерного вибриона

11.1. Определение протективных свойств на взрослых кроликах при их внутрижелудочной иммунизации через зонд и последующем заражении с помощью RITARD - техники (RITARD-модель)

Протективные свойства вакцинного штамма определяются на взрослых кроликах с помощью RITARD (removable intestinal tie-adult rabbit diarrhoea) - техники (RITARD-модель), основанной на внутрикишечном заражении вирулентными штаммами V. cholerae взрослых кроликов с предварительным наложением особой скользящей временной лигатуры на подвздошную кишку в области мезоаппендикса на срок, необходимый для адгезии и ранней колонизации тонкого кишечника холерными вибрионами, и последующего мониторинга инфекционного процесса.

Для определения протективных свойств вакцинного штамма холерного вибриона взрослых кроликов массой (2,5 +- 0,3) кг разделяют на 2 группы: одна интактная, другая - через 14 дней после иммунизации внутрижелудочно через зонд оптимально иммуногенной дозой вакцинного штамма (5 х 10(9) вибрионов). Методика иммунизации приведена в прилож. 7.

Для заражения иммунизированных кроликов используют вирулентный штамм V. cholerae О1 Огава или О139 серогруппы из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Кроликов обеих групп заражают с помощью RITARD-техники (RITARD-модель) вирулентной культурой V. cholerae в дозах 10(6), 10(8), 10(10), 10(12) микробных клеток по 4-5 кроликов на каждую заражающую дозу. За сутки до заражения животных лишают корма без ограничения употребления воды.

11.1.1. Подготовка штаммов V. cholerae к использованию в RITARD-модели

Штамм, предназначенный для заражения животного, бактериологической петлей N 2 засевают в пробирку с 4 - 5 мл 1%-й пептонной воды или бульона Мартена (7,6 - 7,8, выращивают при (37 +- 0,5)°С в течение 6 ч, после чего производят высев на чашки со щелочным агаром рН 8,0. После инкубации при температуре (37 +- 0,5)°С (16 +- 0,5) ч отбирают S-формы колоний и готовят взвесь в 0,9%-м растворе натрия хлорида рН 7,2 по стандартному образцу мутности ОСО-42-28-86П 5 единиц, эквивалентному 1,1 х 10(9) вибрионов. Необходимо заранее рассчитать начало подготовки культуры по времени, чтобы она была готова к моменту проведения оперативного вмешательства.

Животных заражают в дозах 10(6), 10(8), 10(10), 10(12) м. к. в объеме 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида рН 7,2. Контроль правильности приготовления заражающих доз проводят посредством высевов 100 м. к. из разведения 10(-6) (10(3) м.к. в 1 мл) на три чашки качественного щелочного агара с последующим визуальным подсчетом типичных по культурально-морфологическим признакам колоний V. cholerae.

11.1.2. Подготовка и стерилизация хирургического инструментария, шовного и перевязочного материалов

Перед операцией инструменты и иглы кипятят в 1%-м содовом растворе в течение 15 мин. Скальпели кипятят отдельно в 2 - 3%-м растворе соды. Укладывают их на сетку стерилизатора, покрытую одним слоем марли. Учет времени стерилизации ведут с момента явного кипения.

Шелковые нити перед стерилизацией моют в горячей воде с мылом 2 мин, затем прополаскивают, высушивают и наматывают рыхло, не более 4 - 6 рядов, на стеклянные катушки, предметные стекла или стеклянные палочки. Стерилизацию проводят путем погружения в 70° спирт на 48 ч. Синтетические нити, намотанные на стеклянные палочки, стерилизуют кипячением в воде в течение 20 мин.

Для хирургической работы готовят ватные шарики, ватно-марлевые шарики, марлевые тампоны, салфетки, палочки с ватой. Салфетки для покрытия операционного поля размером (20 х 30) см с вертикальным разрезом по центру длиной 10 см изготавливают из льняной ткани. Ватный валик для прикрытия шва, накладываемого на операционную рану, изготавливают из негигроскопичной ваты, растягивая равномерно до длины 12 - 15 см и диаметра 3 см. Перевязочный материал стерилизуют в автоклаве.

11.1.3. Технология RITARD-модели

Из марлевых жгутов, предварительно смоченных 3%-м раствором хлорамина и туго отжатых, делают фиксирующие петли, которые прочно закрепляют на конечностях кролика над суставами во избежание соскальзывания. Затем животное привязывают к станку для фиксации за конечности брюшком кверху. Станок устанавливают в металлический поддон, куда с боков выкладывают смоченные 3%-м раствором хлорамина большие ватные тампоны (на случай излития содержимого брюшной полости во время операции после введения культуры холерного вибриона).

На месте разреза по средней линии от нижнего края грудины до нижней части брюшка (11 - 12 см) шерсть выстригают тупоконечными изогнутыми ножницами и затем удаляют тампоном, смоченным в воде. Место разреза обрабатывают стерильным ватным тампоном, смоченным 70° спиртом, двукратно смазывают кожу 5%-м спиртовым раствором йода.

Животным вводят 1,0 - 1,5 мл миорелаксанта для ветеринарного применения - рометар 2% (ROMETAR, СПОФА, Прага). Оперативное вмешательство проводят под местной анестезией или общим (эфирным) наркозом.

Перед разрезом точно намечают ориентиры, определяющие его правильность, отступая на 2 см от нижнего края грудины до нижней части брюшка по средней линии (11 - 12 см).

После выполнения разреза накладывают стерильную полотняную салфетку (20 х 30) см, предварительно продольно разрезанную по центру и точно такого же размера салфетку из полиэтилена, также разрезанную по центру. Полиэтиленовые салфетки перед операцией замачивают в 70° спирте и ex tempore просушивают во время подготовки животного. Обе салфетки необходимо закрепить к краям разреза четырьмя стерильными хирургическими зажимами.

При помощи двух анатомических пинцетов осторожно извлекают петли кишечника и размещают их на поверхности полиэтиленовой салфетки, периодически смачивая стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида, подогретым до температуры 37°С.

Накладывают постоянную лигатуру на слепую кишку как можно ближе к илеоцекальному соединению. Место наложения выбирают, идя от аппендикса в сторону илеоцекального соединения, избегая попадания кровеносного сосуда в перевязь. Концы лигатуры коротко обрезают. Далее накладывают на подвздошную кишку в области мезоаппендикса "скользящую петлю". Лигатура не должна пересекать ни одного из сосудов. Концы лигатуры должны быть достаточно длинными для того, чтобы можно было их вывести на поверхность и при перистальтике кишечника они не ушли бы вовнутрь брюшной полости. После наложения обеих лигатур петли кишечника орошают теплым 0,9%-м раствором натрия хлорида (не выше температуры 37°С).

Затем в передний отдел тощей кишки вводят приготовленные разведения культуры (10(6), 10(8), 10(10), 10(12) м. к. в объеме 1 мл) вирулентного штамма холерного вибриона. Далее с помощью анатомических пинцетов кишечник погружают в брюшную полость, не допуская перекручивания петель. Концы лигатуры укладывают на покрытый салфеткой край операционной раны, не допуская их натягивания. Накладывают швы на брюшину и кожу (лучше раздельно). При завязывании швов пропускают оба конца лигатуры между любыми двумя близлежащими швами.

Необходимо наложить поверх шва стерильный валик из негигроскопичной ваты с целью предохранения от загрязнения после помещения животного в металлический садок и и закрепить его концом наружных лигатур. Через 2 ч с момента введения культуры холерного вибриона временную лигатуру (скользящая петля), наложенную на подвздошную кишку, снимают.

Перед снятием лигатуры необходимо убедиться в том, что животное находится в спокойном и обездвиженном состоянии под действием наркоза. При появлении первых признаков слабой двигательной активности следует использовать дополнительное внутримышечное введение миорелаксаната (рометара) в дозе 0,5 - 0,7 мл. Дальнейшие действия производят при успокоении животного.

С помощью пинцетов оператор высвобождает концы лигатуры из-под валика, закрывающего шов. Осторожно потягивая за длинный конец, следует регулировать развязывание узла внутри брюшной полости, проявляющееся в свободном прохождении нити. Недопустимо приложение даже малейших усилий. Обычно лигатура развязывается свободно. При затруднении производят слабые качающие движения. После окончательного высвобождения длинного конца следует остановить вытягивание нити из брюшной полости и обрезать под небольшим натяжением короткий конец, чтобы при втягивании в брюшную полость не попадал находящийся на поверхности кожи и подвергающийся контаминации участок. Если лигатура не развязывается, следует распустить 1 - 2 шва в асептических условиях, разрезать лигатуру и заново наложить швы. При возникновении реакции животного на прикосновение инструментов, для повторного наложения швов следует произвести дополнительное местное обезболивание 2%-м раствором лидокаина гидрохлорида.

После снятия лигатуры животное необходимо осторожно вернуть на прежнее место. С целью наблюдения за характером выделений прооперированного животного в качестве подстилочного материала используют лист плотной белой бумаги (в соответствии с размерами металлического садка), подлежащий ежедневной замене. В садок устанавливают миски с водой и кормом (из рациона исключается свекла).

Наблюдение за животными осуществляют в течение 5 сут. в интервалы 16 - 18, 20 - 30, 40 - 42, 44 - 54, 64 - 66, 68 - 78, 88 - 90, 92 - 102, 112 - 120 ч, отмечая признаки экспериментальной холеры: наличие диареи (характер, цвет и обильность выделяемых испражнений на подстилочном материале, присутствие жидких каловых масс на задних лапках и в области анального отверстия, брюшка или грудной части туловища), малая подвижность, взъерошенность шерсти. По своему характеру испражнения могут быть водянистыми; слизистыми, жидкими, бесцветными, белесоватого или калового (желтого, желто-зеленого, бурого) цвета; жидкими кашицеобразными с примесью слизи. Испражнения здорового кролика имеют форму плотных "орешков" бурого или коричневого цвета.

Мониторинг длительности выделения холерных вибрионов инфицированными кроликами осуществляется путем ежедневного забора ректального материала с последующим посевом на щелочной агар и 1%-ю пептонную воду рН 8,0. Выросшие колонии идентифицируют по комплексу признаков в соответствии с МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры". Регистрируют сроки гибели животных. Отдельные животные могут погибнуть в ранние сроки после заражения без визуальных проявлений диареи, описанных выше. На вскрытии у них при осмотре, как правило, регистрируется наличие жидкого содержимого в кишечнике.

Выжившими считают кроликов, оставшихся живыми через 120 ч (5 сут.) наблюдения. По истечении этого срока их забивают и вскрывают. Всех погибших животных, а также всех выживших и умерщвленных через 5 сут. после заражения, подвергают бактериологическому исследованию. Проводят посев содержимого тонкого и толстого кишечника, слизистой тонкого и толстого кишечника на щелочной агар и 1%-ю пептонную воду рН 8,0. Выросшие колонии идентифицируют по комплексу признаков в соответствии с МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры".

Погибшими от холеры считают животных с проявлениями диареи и с положительными результатами бактериологического исследования на холеру.

Дозу вирулентного штамма холерного вибриона (LD_50), вызвавшую гибель 50% кроликов в группе зараженных иммунных и зараженных интактных животных вычисляют по методу, изложенному в монографии И.П. Ашмарина и В.В. Воробьева (1962). Рассчитывают индекс иммунитета (ИИ) - отношение величины LD_50 заражающего штамма для иммунных животных к величине LD_50 этого же штамма для контрольных животных. Чем выше индекс иммунитета, тем иммуногеннее испытуемый штамм.

При правильном выполнении технологии метода RITARD кролики без какого-либо антигенного или лекарственного воздействия, которым вместо культуры холерных вибрионов внутрикишечно введен 0,9%-й раствор хлорида натрия, имеют продолжительность жизни свыше 120 ч (5 сут.). Признаки диареи у них отсутствуют.

11.2. Оценка иммуногенности штамма по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов

Трех кроликов массой 2,5 - 3 кг иммунизируют дозой 5 x 10(9) вибрионов испытуемого штамма внутрижелудочно через зонд (см. п. 11.1). Через 14 сут. после иммунизации у них определяют иммуногенность по снижению количества прикрепившихся к кишечному эпителию вибрионов.

Для определения адгезии холерных вибрионов в лигированную петлю (длиной 10 см) тонкой кишки 3-х иммунизированных 3-х интактных взрослых кроликов вводят по 2 мл взвеси вирулентного штамма холерного вибриона концентрацией 10(6) клеток/мл. Через 4 ч кроликов умерщвляют. Лигированную петлю каждого кролика извлекают и помещают в кювету. В петлю вводят 10 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида и промывают поочередно, поднимая за лигатуры концы петли. Затем содержимое петли переносят в пробирку. Петлю кишки помещают в гомогенизатор с 30 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. После гомогенизации полученный гомогенат переносят в стерильную колбочку. Из смыва и гомогената высевают по 0,1 мл из каждого на 10 чашек со щелочным агаром. Посевы инкубируют при 37°С в течение 18 ч. Подсчитывают количество выросших колоний холерных вибрионов. По числу выросших колоний рассчитывают количество вибрионов во всем объеме смыва и во всем объеме гомогената промытой петли тонкой кишки. Затем по этим величинам определяют процент адгезировавшихся холерных вибрионов от общего количества вибрионов, обнаруженных в лигированной петле (в смыве + в гомогенате). Например, на 10 чашках из смыва (посеян 1 мл) выросло 108 колоний холерных вибрионов, в 10 мл будет 1 080 вибрионов. На 10 чашках с посевами гомогената (посеян 1 мл) выросло 12 колоний, в 30 мл гомогената будет 360 колоний. Всего содержалось 1 440 вибрионов (100%), неадгезировавшиеся вибрионы составили 75%.

У иммунных животных должно наблюдаться статистически достоверное снижение адгезии вирулентного штамма холерного вибриона (р = 0,05 и менее).