Приложение 4 (обязательное). Определение "остаточной" токсигенности (выявление фактора сосудистой проницаемости и дерматонекротического фактора) холерного вибриона в кожной пробе на взрослых кроликах

Приложение 4
(обязательное)

Определение "остаточной" токсигенности (выявление фактора сосудистой проницаемости и дерматонекротического фактора) холерного вибриона в кожной пробе на взрослых кроликах

Исследуемую культуру вначале высевают на щелочной мясопептонный агар рН 7,4 - 7,6 и инкубируют 18 - 20 ч при температуре 37°С. Затем колонии в S-форме пересевают в 3%-ю пептонную воду с 0,5% натрия хлорида рН 7,6. Через 4 ч выращивания 0,2 мл бульонной культуры высевают на поверхность агара, покрытого целлофановой пленкой. Чашки с посевами крышкой вверх инкубируют при температуре 37°С в течение 18 - 20 ч. Выросшую культуру холерных вибрионов смывают с поверхности целлофана 2,5 мл забуференного 0,9%-го раствора натрия хлорида и переносят в стерильную пробирку.

Для определения токсигенности следует приготовить взвеси вибрионов, содержащие в 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида 2 х 10(9), 1 х 10(9), 5 х 10(8), 2,5 х 10(8), 1,25 х 10(8) и 6,25 х 10(7) микробных клеток в 1 мл.

В опыт берут 4 белых или светло-серых кроликов массой 2,5 - 3,0 кг. За 24 ч до опыта удаляют шерсть с боковых поверхностей спины, используя депилаторий. После этого кожу тщательно промывают теплой водой и протирают полотенцем. Перед опытом поверхность кожи протирают стерильным ватным тампоном, смоченным спиртом и хорошо отжатым, а затем тампоном, смоченным стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида. Заражение животных проводят с соблюдением режима работы с возбудителем холеры. В депилированную поверхность кожи трех взрослых кроликов вводят внутрикожно по 0,1 мл культуры из каждого приготовленного разведения, начиная с меньшей дозы, по 2 ряда с каждой стороны на возможно отдаленном расстоянии. Четвертому кролику по 2 ряда с двух сторон вводят по 0,1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида (контроль). Результаты учитывают через 24 ч, измеряя линейкой и циркулем размер образовавшейся папулы. За положительную реакцию принимают папулы размером 6 мм и более, папулы меньшего размера не учитывают.

Во время вскрытия у кроликов берут материал из органов и тканей для гистологического исследования.

Токсигенные штаммы вызывают кожную реакцию в дозах от 6,25 х 10(7) до 1,25 х 10(8) м.к./мл.

Умеренно токсигенные штаммы вызывают кожную реакцию в дозе 2,5 х 10(8) м.к./мл.

Слаботоксигенные штаммы вызывают кожную реакцию в дозах до 5 х 10(8) м.к./мл.

Атоксигенные вызывают кожную реакцию лишь в дозах свыше 5 x 10(8) м.к./мл.

Вакцинный штамм должен быть атоксигенным в опытах с кожной пробой.

Для выявления дерматонекротического фактора и токсических ферментных комплексов из суспензии микробных клеток, смытых с поверхности целлофана, готовят указанные выше разведения культуры. В депилированную поверхность кожи кролика вводят внутрикожно по 0,1 мл. Учет результатов проводят через 24 ч. Отмечают наличие некротических изменений в месте укола. Дерматонекротический фактор определяют по наличию зоны некроза не менее 2 мм.

Вакцинный штамм не должен вызывать некроза при внутрикожном введении.