Приложение 8 (обязательное). Определение влияния вакцинных штаммов холерного вибриона на иммунную систему взрослых кроликов

Приложение 8
(обязательное)

Определение влияния вакцинных штаммов холерного вибриона на иммунную систему взрослых кроликов

Методика подготовки испытуемого штамма для данных испытаний аналогична описанной в прилож. 3.

Влияние испытуемого штамма на иммунную систему определяют на кроликах породы "шиншила" массой 2 - 3 кг. Экспериментальных животных иммунизируют согласно прилож. 6 внутрижелудочно через зонд однократно дозами 5 x 10(7) м.к. и 5 х 10(9) м.к. Иммунологические исследования проводят через 1, 3, 7, 14 и 28 сут. после введения испытуемого штамма. При обнаружении изменений в показателях необходимо срок наблюдения продлить до восстановления изучаемых показателей до исходного уровня и (или) уровня в контрольных группах.

Животных для данных опытов (по 5 кроликов массой 2,5 - 3 кг в группе) используют тех же, что и для определения безвредности, реактогенности и приживаемости штамма (прилож. 7) и при определении протективной активности при внутрижелудочном введении взрослым кроликам (прилож. 11). Проводят описанные ниже виды исследований в соответствии с РД 42-28-10-90 и "Медицинскими лабораторными технологиями" (Справочник, 2002).

8.1. Определение количества лейкоцитов в крови

Готовят 3%-й раствор уксусной кислоты, подкрашенный для окраски ядер лейкоцитов несколькими каплями раствора метиленового синего. Раствор имеет голубой цвет, длительно хранится. В пробирку с 1,9 мл раствора уксусной кислоты вносят 0,1 мл крови (можно использовать стабилизированную антикоагулянтами венозную кровь) и перемешивают. Каплю содержимого пробирки помещают в счетную камеру Горяева. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин для оседания лейкоцитов. Затем помещают ее на столик микроскопа и при малом увеличении (окуляр 10х, объектив 8х) подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах. Расчет лейкоцитов проводят по формуле:

                               а х 250 х 20

                           X = ------------ = а х 50, где

                                   100

X   - число лейкоцитов в 1 мкл крови;

а   - число лейкоцитов в 100 больших квадратах;

20  - разведение крови;

100 - число больших квадратов;

250 - коэффициент  пересчета  на  1  мкл,  т.к.  объем  одного  большого

      квадрата  равен  1/250 мкл  (сторона  квадрата - 1/5 мм,  высота -

      1/10 мм).

Практически для расчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови их число в 100 больших квадратах умножают на 50, а в 1 л - полученную величину умножают еще на 10(6).

8.2. Определение лейкоцитарной формулы

Лейкоцитарной формулой называется процентное соотношение различных видов лейкоцитов, определяемое при подсчете их в мазке крови.

Для приготовления мазка на чистое, сухое, обезжиренное предметное стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места прокола) небольшую каплю крови, оставляя стекло в горизонтальном положении каплей вверх. Влево от капли прикладывают плотно ребром шлифованное стекло под углом 45° и соединяют его с каплей. Ждут несколько секунд, пока капля не расплывется полностью вдоль ребра шлифованного стекла. После этого быстрым, равномерным движением, не сильно надавливая, проводят по стеклу полосу в сторону, противоположную от капли. Мазки высушивают на воздухе. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, занимать почти всю длину стекла и заканчиваться неровными зигзагами в виде "метелочки". Фиксацию проводят в этиловом (10 мин) или метиловом (4 мин) спирте, окрашивают по Романовскому-Гимзе. В качестве красителя используют готовый раствор Романовского-Гимзы, который перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл нейтральной (рН 7,0) дистиллированной воды. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой партии красителя (25 - 40 мин).

Мазки просматривают в световом микроскопе (иммерсионная система, объектив 90х, окуляр 7х или 10х). На каждом стекле суммарно просчитывают не менее 200 клеток, учитывая отдельные виды лейкоцитов. Исходя из полученных результатов, вычисляют процентное содержание нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и других клеток белой крови. Чтобы определить содержание отдельных видов лейкоцитов в 1 мкл крови в абсолютных числах, необходимо сначала подсчитать общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови и, отбросив две последние цифры, умножить на процентное содержание отдельного вида. Например: количество лейкоцитов в 1 мкл крови равно 5 000, процент лимфоцитов равен 30. Следовательно, абсолютное количество лимфоцитов в 1 мкл крови будет составлять 50 x 30 = 1500.

8.3. Выделение лимфоцитов из крови кроликов

Кровь у кроликов берут из ушной вены в объеме 2 мл в пробирку со средой 199 или раствором Хенкса с гепарином (25 +- 0,5) ед/мл в соотношении 1 часть крови и 3 части среды. После перемешивания разведенную кровь наслаивают в пробирке на водный раствор верографина плотностью (1,077 +-0,002) г/мл, не допуская смешивания слоев. Соотношение объемов 2:1. Затем центрифугируют (15 +- 1) мин при (450 +- 25) g. Пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром собирают образовавшееся над слоем верографина беловатое кольцо лимфоцитов. Полученная взвесь клеток содержит примесь компонентов градиента плотности и тромбоцитов, которые удаляют путем 2-кратного отмывания клеток охлажденным раствором Хенкса без ионов магния и кальция. Режим центрифугирования - (10 +- 1) мин при (280 +- 20) g. По завершении процесса отмывания клеток, осадок ресуспендируют в среде 199 или среде Игла. Необходимая для дальнейших исследований концентрация клеток должна составлять 2,0 х 10(6) клеток в 1 мл.

8.4. Определение количества лимфоцитов во взвеси

Из полученного 1 мл клеточной взвеси после ресуспендирования отбирают 0,02 мл и переносят в пробирку с 0,38 мл 3%-го раствора уксусной кислоты, подсиненной раствором метиленового синего, затем перемешивают. Каплю содержимого пробирки помещают в счетную камеру Горяева. Клетки считают под микроскопом при малом увеличении (окуляр 10х, объектив 8х) в 100 больших квадратах и умножают полученное число на 5,0 х 10(4) (коэффициент пересчета количества клеток, подсчитанных в камере Горяева, в количество клеток, содержащихся в 1 мл взвеси). Необходимая для дальнейших исследований рабочая концентрация клеток должна составлять 2,0 х 10(6) клеток в 1 мл.

8.5. Определение жизнеспособности лимфоцитов

К 0,1 мл взвеси лимфоцитов в рабочей концентрации добавляют 1 каплю 0,2%-го раствора трипанового синего (или 0,1 мл 0,2%-го эозина БА (индикатор, чда, по ТУ 6-09-260-70) в 0,9% растворе натрия хлорида, рН 7,2). Суспензию оставляют на 30 с при температуре (20 +- 2)°С, а затем под микроскопом в камере Горяева учитывают результат. Живые лимфоциты остаются бесцветными, а погибшие клетки окрашиваются. При соблюдении правил выделения лимфоцитов живых клеток должно быть не менее 98%.

8.6. Определение Т-лимфоцитов в крови кролика цитотоксическим тестом

Цитотоксический тест используется для выявления антигенов клеточных мембран, специфичных для определенной субпопуляции клеток. Основной принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против специфических лимфоцитарных антигенов, фиксируются на клетках, экспрессирующих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целостность клеточной мембраны. Нарушение целостности мембраны лимфоцитов позволяет проникать внутрь клетки прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) и окрашивать их. Жизнеспособные клетки этим красителем не окрашиваются.

Поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в лунке панели смешать 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 2,0 х 10(6) кл/мл) и 20 мкл комплемента кролика в разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 2,0 х 10(6) кл/мл), 20 мкл взвеси комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (37 +- 2)°С в течение 25 - 30 мин. В каждую пробирку или лунку добавляют по 1 200 мкл 0,5%-го раствора трипанового синего. (Для приготовления указанного раствора 500 мг красителя растворяют в 100 мл горячего 80 - 90°С 0,9%-го раствора натрия хлорида; перемешивают 10 мин на магнитной мешалке и фильтруют через фильтровальную бумагу). Через 30 - 60 с взвесь из лунки помещают в счетную камеру Горяева. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в опыте и контроле, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

              % погибших клеток при опыте - % погибших клеток в контроле

  ЦТИ = 100 х ----------------------------------------------------------

                        100 - % погибших клеток в контроле

ЦТИ указывает, какой процент клеток в исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции.

8.7. Определение В-лимфоцитов в крови кролика (одним из низке приведенных методов)

8.7.1. Определение количества В-лимфоцитов цитотоксическим тестом

Общее количество В-лимфоцитов определяют в цитотоксическом тесте с поликлональной специфической сывороткой к антигенным маркерам В-лимфоцитов. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти-Т-сывороткой.

8.7.2. Определение количества В-лимфоцитов иммунофлюоресцентным методом

Принцип метода основан на том, что В-лимфоциты несут поверхностные иммуноглобулины, которые выявляются в реакции иммунофлюоресценции с помощью антииммуноглобулиновых антител, меченных флюорохромом.

В пробирки, помещенные на ледяную баню, вносят 0,1 - 0,25 мл суспензии лимфоцитов (2 х 10(6) лимф./мл) в растворе Хенкса с 1 - 2%-м раствором бычьего сывороточного альбумина. Затем добавляют равный объем диагностических флуоресцирующих антивидовых, против иммуноглобулинов кролика, антител в рабочем разведении. Для приготовления раствора антител используют забуференный 0,9%-й раствор натрия хлорида. Смесь инкубируют и помешивают в течение 30 мин при (4 +- 0,5)°С в присутствии 0,25%-го раствора азида натрия, после чего суспензию клеток 3 раза отмывают, добавляя к осадку раствор Хенкса и центрифугируя (10 +- 1) мин при (450 +- 20) g. Последнее (третье) отмывание проводят охлажденным до 4°С забуференным 0,9%-м раствором натрия хлорида, т.к. раствор Хенкса и среда 199 обладают оптической активностью и могут искажать результаты микроскопии. Осадок ресуспендируют в 0,05 мл забуференного 0,9%-го раствора натрия хлорида и наносят на тщательно вымытое и обезжиренное предметное стекло (из нефлуоресцирующего стекла), с проведенными парафиновым стеклографом окружностями, ограничивающими исследуемый материал. Накрывают покровным стеклом, окантовывают вазелином и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа, используя светофильтры, рекомендованные инструкцией для ФИТЦ, и масляную иммерсионную систему. При микроскопии учитывают клетки, имеющие кольцевое или точечное (гранулярное) свечение. Диффузно окрашенные клетки не учитываются. Параллельно с помощью фазово-контрастного устройства проводят подсчет количества клеток в каждом поле зрения. Относительное процентное содержание В-лимфоцитов определяют после подсчета 200 - 300 клеток в препарате по формуле:

                               В x 100

                           X = -------, где

                                  А

А - общее количество клеток;

В - количество клеток со специфическим свечением.

Для подсчета абсолютного содержания В-лимфоцитов используют следующую формулу:

                            А х Б х В

                        Д = ---------, где

                             10 000

Д - абсолютное содержание В-лимфоцитов в 1 л крови;

А - количество лейкоцитов в 1 л крови;

Б - процентное содержание лимфоцитов в пуле лейкоцитов крови;

В - процентное содержание В-лимфоцитов в пуле лимфоцитов крови.

Результаты исследований отражают в таблице:

Сутки исследования	Абсолютное содержание		Относительное содержание (%)
	В-лимфоциты	р с К	В-лимфоциты	р с К
Контроль(К)
1
3
7
14
28

Примечание: р - уровень достоверности различий (р < 0,05)

8.8. Определение фагоцитарной активности макрофагов

Фагоцитарная активность (ФА) макрофагов оценивается по следующим показателям: процент фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарное число (ФЧ) - количество микробных клеток на один фагоцит.

Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от кроликов опытной и контрольной групп. Делают разрез по срединной линии передней брюшной стенки и осторожно отсепаровывают кожный лоскут, не нарушая целостности брюшины. Через прокол иглой, соединенной со шприцем, в брюшную полость вводят 20 мл среды 199, содержащей 5 ME гепарина в 1 мл. Осторожно массируют переднюю брюшную стенку. Через 3 - 5 мин через надрез в брюшине пастеровской пипеткой, соединенной с резиновой грушей, собирают содержимое и сливают через нейлоновый фильтр в пробирки, стоящие на льду. Не используют экссудаты, содержащие примесь эритроцитов. Затем клетки осаждают центрифугированием (280 +- 20) g при температуре (4 +- 0,5)°С в течение (10 +- 1) мин, ресуспендируют в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) до конечной концентрации 2 х 10(6) кл/мл. Полученную суспензию клеток разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм, которые инкубируют при температуре (37 +- 0,5)°С в атмосфере с 5% СО2. Через 60 мин смывают неприкрепившиеся к пластику клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды 199 и инкубируют в течение следующих 18 ч при температуре (37 +- 0,5)°С в атмосфере с 5% СО2.

Клетки для исследования фагоцитоза можно получить также на половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5 - 2 мл КПЭ.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, дрожжеподобные грибки Candida albicans или лабораторный штамм Staphylococcus (9198) или любые другие микробные клетки. Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре 90°С микроорганизмов отмывают не менее 3-х раз 0,9%-м раствором натрия хлорида, ресуспендируют и определяют концентрацию суспензии клеток по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц. Взвесь клеток разводят средой 199 до концентрации, соответствующей 1 - 2 х 10(9) м.к./мл.

Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывают 0,9%-м раствором натрия хлорида рН 7,2, осаждая центрифугированием при (400 +- 20) g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ю взвесь ЭБ на среде 199.

В чашки Петри, содержащие КПЭ, вносят по 1 мл свежей среды 199 и по 1 мл 0,5% взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов (концентрация 1 - 2 х 10(9) м.к./мл) и инкубируют при температуре (37 +- 0,5)°С в атмосфере 5% СО2. Через 30 - 60 мин чашки промывают холодным раствором Хенкса, высушивают при комнатной температуре, фиксируют в метаноле (или в смеси Никифорова) или парами 10%-го раствора формалина (5 - 10 мин), окрашивают по Романовскому-Гимзе.

При микроскопии препаратов учитывают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробных клеток.

Результаты оценивают по следующим показателям: процент фагоцитирующих клеток (ФА) и фагоцитарное число (ФЧ), которое определяется средним числом поглощенных ЭБ или микроорганизмов на один фагоцит.

Процент фагоцитирующих клеток (ФА) рассчитывается по формуле:

                         В x 100

                    ФА = -------, где

                            А

А - общее количество клеток;

В - количество  фагоцитирующих клеток (фагоциты с  поглощенными  ЭБ  или

    микробными клетками).

Результаты исследований представляют для каждой дозы в таблице:

Сутки исследования	ФА	р с контролем	ФЧ	р с контролем
Контроль
1
3
7
14
28

Примечание: р - уровень достоверности различий (р < 0,05)

8.9. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) спонтанная и митогениндуцированная Т- и В-митогенами

Реакция бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Т- и В-клеточных митогенов служит для оценки функциональной активности лимфоцитов. Специфическое распознавание митогена индуцирует в клетках процесс пролиферации, т.е. деление клеток. Митогены селективно стимулируют пролиферацию различных субпопуляций лимфоцитов. КонА стимулирует тимоциты, зрелые и незрелые Т-клетки, ФГА стимулирует пролиферацию только зрелых Т-клеток. Такие митогены, как липополисахарид и бактериальный липопротеин стимулируют пролиферацию В-клеток. Благодаря этой селективности, митогены могут использоваться для характеристики функционального состояния различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток.

Для спонтанной РБТЛ суспензию спленоцитов (5 x 10(6) кл./мл) готовят на "среде для культивирования клеток" (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10(-5) М 2-меркапто-этанола, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Суспензию клеток разливают в 96-луночную пластиковую панель по 200 мкл в лунку (по три лунки на каждый образец) и инкубируют в СО2-инкубаторе (5% СO2) при температуре 37°С в течение 72 ч. Затем добавляют (3)Н-тимидин в объеме 25 - 50 мкл (1 - 2 мкКИ в среде RPMI-1640) на лунку и инкубируют в тех же условиях 16 - 24 ч. По окончании инкубации клетки переносят на фильтры с помощью прибора "Cell Harwester", фильтры после сушки в термостате при температуре 37°С помещают во флаконы, содержащие по 3 мл сцинтилляционной Harwester жидкости (на 1 л толуола 0,2 г РОРОР и 5 г РРО). Уровень радиоактивности метки (имп/мин) измеряют с помощью бета-сцинтилляционного счетчика любого типа.

Постановку РБТЛ под влиянием митогенов осуществляют так же, как спонтанную, только в опытные лунки добавляют Т- или В-клеточные митогены (не менее 3 лунок на каждый митоген) в оптимальной стимулирующей дозе (КонА 1 - 15 мкг/мл, ФГА 10 - 15 мкг/мл, ЛПС 15 - 100 мкг/мл). Контролем служат лунки со взвесью лимфоцитов без добавления митогенов.

Учет результатов

Результаты представляют в виде индексов стимуляции клеток (ИС), которые подсчитывают по формуле:

                 количество имп/мин в культуре с митогеном (опыт)

          ИС = -----------------------------------------------------

               количество имп/мин в культуре без митогена (контроль)

Результаты исследований отражают в таблице.

Сутки	N кролика	ИС Т-клеток				ИС В-клеток
		ФГА	р с К	Con A	р с К	ЛПС	р с К
7
14
28
Контроль (К)

Примечание: р - уровень достоверности различий (р < 0,05).

8.10. Определение поликлональной активности В-лимфоцитов

Для оценки этого показателя определяют число клеток, продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК). Необходимо подчеркнуть, что иммунизация кроликов эритроцитами барана в этих опытах не проводится, а определяют количество спонтанных "фоновых" АОК в селезенке. Увеличение их количества после введения вакцины является показателем поликлональной активации В-лимфоцитов. Число АОК в селезенке определяют методом локального гемолиза в геле.

Выявление антителообразующих клеток методом локального гемолиза в геле производят следующим образом.

Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывают 0,9%-м раствором натрия хлорида рН 7,2, осаждая центрифугированием при (400 +- 20) g в течение 7 мин, добавляют к 0,9%-му раствору агарозы из расчета 2 - 3 х 10(7) эритроцитов в 1 мл. Полученную рабочую смесь разливают по 2,5 мл в пробирки, помещенные в водяную баню при температуре 43 - 44°С. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток селезенки кроликов (концентрация 10(7) кл/мл), перемешивают и выливают в чашку Петри диаметром 90 мм, равномерно распределяя по дну. Через 5 мин чашки помещают в термостат при температуре (37 +- 0,5)°С на 1 ч. Затем в каждую чашку вносят путем наслаивания по 2,5 мл комплемента морской свинки (сухого), разведенного в 5 раз средой 199 или разведенного в 10 раз свежезамороженного комплемента. После 30 мин инкубации при температуре (37 +- 0,5)°С, подсчитывают число зон гемолиза на каждой чашке. Рассчитывают число АОК на 1 х 10(6) ядросодержащих клеток селезенки. Рассчитывают индекс поликлональной стимуляции (ИПС) по формуле:.

             число АОК на 10(6) ядросодержащих клеток селезенки в опыте

     ИПС = -------------------------------------------------------------

           число АОК на 10(6) ядросодержащих клеток селезенки в контроле

Результаты исследований для кроликов, иммунизированных дозами (5 х 10(7) и 5 x 10(9) вибрионов) отражают в таблице.

Сутки	Число АОК на 10(6)	р с К	Индекс поликлональной стимуляции
Контроль (К)
3
7
14
28

Примечание: р - уровень достоверности различий (р < 0,05)

Приготовление 0,9%-ного раствора агарозы. Навеску сухой агарозы (см. табл.) смешивают с дистиллированной водой, смесь кипятят на водяной бане до полного растворения агарозы; емкость с раствором переносят в водяную баню с температурой 43 - 44°С, добавляют 10-кратный раствор Хенкса, рН раствора до 7,2 - 7,4 доводят 1%-м раствором КН2РО4 или 7,5%-м раствором натрия бикарбоната (по цвету индикатора, присугствующего в растворе Хенкса и имеющего при значениях рН 6,8 - 7,0 желтовато-оранжевый цвет, 7,2 - 7,4 розовато красный цвет, при значениях рН выше 7,4 - малиновый цвет).

Количество чашек	Масса агарозы	Объем дистиллированной воды	Объем концентрата раствора Хенкса (10-кратный)
10	225 мг	22,5 мл	2,5 мл

8.11. Исследование иммунореактивности на гетерологичный антиген

Исследуют влияние испытуемого штамма на развитие иммунного ответа кроликов на гетерологичный антиген (эритроциты барана) по формированию АОК к эритроцитам барана (ЭБ).

Для проведения этих экспериментов кроликов разделяют на 2 группы по 5 штук в каждой. Кроликов первой группы иммунизируют изучаемым штаммом внутрижелудочно через зонд однократно дозой 5 х 10(9)м.к. (см. прилож. 6), кролики второй группы - контрольные (интактные). Кроликам обеих групп вводят внутривенно по 1 мл 50%-й взвеси отмытых эритроцитов барана. Иммунный ответ на гетерологичный антиген оценивают по количеству АОК (методика определения АОК см. п. 8.10) через 4 сут. после введения эритроцитов. Рассчитывают индекс поликлональной стимуляции (ИПС) по формуле:

            число АОК на 10(6) ядросодержащих клеток селезенки в опыте

     ИПС = -------------------------------------------------------------

           число АОК на 10(6) ядросодержащих клеток селезенки в контроле

Результаты исследований отражают в таблице:

Группа кроликов	АОК к ЭБ	Индекс стимуляции	р с контрольными животными
Иммунизированные
Контрольные

Примечание: р - уровень достоверности различий (р < 0,05).