Приложение 3 (обязательное). Определения "остаточной" вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков

Приложение 3
(обязательное)

Определения "остаточной" вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков

Для заражения используют 4-часовую культуру испытуемого штамма, выросшую при температуре (37 +-1)°С. Штамм засевают в пробирку с 5 мл 1%-й пептонной воды (ФСП 42-0010-2040-01, ФСП 42-0026-2128-01 или ФС 42-3040-98), выращивают при температуре (37 +- 1)°С в течение 3 - 4 ч, после чего производят пересев на чашки Петри со щелочным агаром (ФСП 42-0010-2989, ФСП 42-0026-2132-01 или ФС 42-3405-97). После 18 - 20 ч инкубации при температуре (37 +- 1)°С культуру отсевают на свежеприготовленные и не подсушенные пластинки со щелочным агаром в чашках Петри, инкубируют 3 - 4 ч при температуре (37 +- 1)°С и используют для заражения. Взвесь вибрионов готовят в 0,9%-м растворе натрия хлорида концентрацией 1,1 х 10(9) вибрионов в 1 мл по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-86П 5 единиц, эквивалентному 1,1 х 10(9) вибрионов в 1 мл. Кроликам-сосункам массой 10 - 12 г вводят три дозы 10(5), 10(7) вибрионов в объеме 0,2 мл внутрикишечно. Каждой дозой заражают двух кроликов-сосунков. Для заражения используют свежеприготовленные взвеси. Заражающую дозу контролируют путем высева на две пластинки щелочного агара в чашках Петри по 0,1 мл взвеси из разведения, содержащего 1 х 10(3) вибрионов в 1 мл.

Крольчат два раза в сутки кормят молоком, закапывая его в рот шприцом без иглы.

Инструменты и материалы, необходимые для заражения:

- две малые стеклянные воронки с ватными тампонами для эфирного наркоза;

- глазной пинцет, два больших пинцета (анатомический и хирургический), ножницы (большие и малые), скальпель, два хирургических зажима, 5 - 6 хирургических игл N 3-4;

- шелк хирургический в спирте;

- скобки Мишеля (в спирте);

- эфир, спирт, 5%-я настойка йода;

- марлевые салфетки и тампоны;

- туберкулиновые или однокубиковые шприцы с иглами.

Техника операции

Кроликов в возрасте 10 - 12 дней, массой 130 - 160 г фиксируют к станку брюшком вверх, выстригают шерсть на операционном поле и смазывают его раствором йода. Дают эфирный наркоз или внутримышечно тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1%-го раствора ни 100 г массы). Животное покрывают стерильной салфеткой с разрезом в центре. Стерильными ножницами или скальпелем делают разрез по средней линии живота на уровне пупка длиной 1 см, отсепаровывают кожу пинцетом, делают небольшой разрез брюшной стенки. Извлекают петлю тонкого кишечника (на длинной брыжейке), которую фиксируют с помощью хирургического пинцета. В просвет кишки шприцем вводят 0,2 мл взвеси, содержащей 10(5) или 10(7) вибрионов, петлю погружают в брюшную полость. Послойно зашивают брюшную стенку и кожу (на разрез кожи можно наложить скобки Мишеля). Шов смазывают йодом. Все манипуляции выполняют с соблюдением правил асептики. Оперированных животных кормят с помощью шприца и других приспособлений молоком и наблюдают за ними в течение 48 ч.

Учет результатов

У кроликов регистрируют общее состояние (подвижность, отсутствие взъерошенной шерсти и судорог), отсутствие признаков диареи (жидкие каловые массы на задних лапках и в области анального отверстия, брюшка или грудной части туловища). Всех погибших или умерщвленных через 48 ч животных вскрывают, внутренние органы подвергают морфологическому исследованию и производят высев содержимого тонкого и толстого кишечника на питательный щелочной агар. Выросшую культуру холерного вибриона идентифицируют с помощью реакции агглютинации на стекле с сывороткой диагностической холерной О1 или О139.

Во время вскрытия обращают внимание, в первую очередь, на сухость тканей и изменения со стороны желудочно-кишечного тракта. Вакцинный штамм не должен вызывать синдрома энтеропатогенности (холерогенности): не должно быть выраженных изменений в толстом кишечнике, петли кишечника не должны быть растянуты жидкостью (бесцветной, светло-желтой или мутной коричнево-желтой). Жидкость из кишечника перенести в пробирку.

Во время вскрытия из органов и тканей берут материал для гистологического исследования.

Авирулентные вибрионы не вызывают заболевания, гибели кроликов-сосунков и макроскопических изменений в кишечнике.