Приложение 1 (обязательное)

Приложение 1
(обязательное)

Определение отсутствия у вакцинного штамма холерного вибриона гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного токсина методом ПЦР

Отсутствие гена, кодирующего А-субъединицу холерного токсина, определяют с помощью тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae ctx А(+) методом полимеразной цепной реакции (ФСП 42-0020-3806-03) в соответствии с инструкцией по применению и с помощью тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae ctx A tcp А с праймерами N 1 и N 2 (прилож. 2).

1. Подготовка испытуемого и контрольного штаммов холерного вибриона. Для получения микробной взвеси испытуемого и контрольного штаммов, в качестве которого используют штамм V. cholerae 569B ctx A(+) ампулы с лиофилизированными культурами стерильно вскрывают и вносят в них 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида мерной пипеткой емкостью 1 - 2 мл II класса точности. После растворения микробную взвесь в объеме 0,1 мл засевают с помощью этой пипетки в 1% пептонную воду (ФСП 42-0010-2040-01 или ФСП 42 0026-2128-01), инкубируют в течение 3 - 6 ч при температуре (37 +- 1)°С. Затем производят высев с помощью бактериальной петли N 2 на агар Хоттингера (МУК 4.1/4.2.588-96. С. 46) рН 7,6 +- 0,1, инкубируют при температуре (37 +- 1)°С в течение 18 - 20 ч.

2. Получение ДНК. Взвесь односуточной культуры изучаемого и контрольного штаммов, выращенных на агаре Хоттингера рН 7,6 +-0,1, готовят в 2 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида по стандартному образцу мутности 5 единиц (ОСО 42-28-86П), что соответствует 1,1 х 10(9) вибрионов в 1 мл. Затем делают 10-кратные разведения взвесей (0,5 мл взвеси и 4,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида) до концентрации 1 х 10(5), 1 х 10(4) и 1 х 10(3) м.к./мл. Количество клеток проверяют высевом 0,1 мл из разведения с концентрацией 1 х 10(3) м.к./мл на агар Хоттингера рН 7,6 +- 0,1. Через 24 ч инкубации в термостате при температуре (37 +- 1)°С подсчитывают количество выросших колоний (на агаровых пластинках должно вырастать не менее 30 колоний) и количество м.к./мл культуры, умножив полученную величину на разведение.

Обеззараживание культуры проводят согласно МУ 3.5.5.1034-01 (п. 5.1.1) добавлением к микробной взвеси, содержащей 1 х 10(9), 1 х 10(5) и 1 х 10(4) м.к. в 1 мл 0,1%-го раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,01% (1:10 000) и прогревают на водяной бане при температуре (56 +- 1)°С в течение 30 мин согласно п. 5.1.1 МУ 3.5.5.1034-01. После этого работа может проводиться как с обеззараженным материалом.

3. Выделение ДНК. 1 мл обеззараженной бактериальной взвеси переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 8 000 g - в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 50 мкл стерильной деионизованной воды, лизируют на кипящей водяной бане в течение 10 мин и центрифугируют при 8 000 g в течение 1 мин. Супернатант в количестве 10 мкл используют для проведения ПЦР.

4. Проведение полимеразной цепной реакции. Проведение и учет полимеразной цепной реакции проводят в соответствии с Инструкцией по применению на тест-систему диагностическую для выделения ДНК Vibrio cholerae ctxA методом полимеразной цепной реакции.