Приложение 10 (обязательное). 10. Определение иммуногенности вакцинного штамма холерного вибриона

Приложение 10
(обязательное)

10. Определение иммуногенности вакцинного штамма холерного вибриона

Для определения иммуногенности испытуемого вакцинного штамма холерного вибриона используют взрослых кроликов массой 2 - 3 кг. Животных делят на три группы по 16 особей в каждой. Первую группу животных иммунизируют внутрижелудочным введением 5 х 10(7) м.к., вторую - 5 х 10(9) м. к. и третью - 5 х 10(10) м.к./мл. Исследование проводят до иммунизации, через 3, 7, 14 и 28 сут. после иммунизации. Для этого умерщвляют по 4 кролика из каждой группы. Перед умерщвлением у животных производят забор крови для определения агглютинирующих, вибриоцидных и антитоксических антител. От умерщвленных животных берут содержимое кишечника для определения копроантител.

Вакцинный штамм должен вызывать накопление в сыворотке крови агглютинирующих, вибриоцидных и антитоксических антилел, в кишечнике - копроантител в статистически значимых количествах.

10.1. Определение агглютинирующих антител в сыворотке крови кроликов

Агглютинирующие антитела определяют в пробирочной реакции агглютинации. Для этого испытуемую сыворотку разводят 0,9%-м раствором натрия хлорида до 1:10 и далее последовательно двукратно до разведения 1:320. Титры агглютинирующих антител определяют со штаммами V. cholerae M-800 биовара эльтор серовара Огава, V. cholerae M-879 биовара эльтор серовара Инаба, V. cholerae 569-B классического биовара серовара Инаба и V. cholerae M-41 классического биовара серовара Огава. Для этого в 4 ряда пробирок вносят по 0,5 испытуемой сыворотки каждого разведения и добавляют в каждый ряд по 0,5 мл взвеси вышеуказанных штаммов холерных вибрионов. Каждая взвесь должна содержать 1 x 10(9) вибрионов в 1 мл (5 единиц по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-86П), выращенных при температуре 37°С в течение 18 - 20 ч на пластинках щелочного агара для культивирования холерных вибрионов. Для контроля используют пробирки с 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл взвеси холерных вибрионов, разведенных 0,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. Затем пробирки тщательно перемешивают путем осторожного встряхивания и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 ч и далее на 18 - 20 ч при температуре 18 - 22°С. Реакцию учитывают как положительную при ясно видимых хлопьях агглютината (+++), при отсутствии таковых в контрольных пробирках. За титр сыворотки принимают ее наибольшее разведение, в котором отмечалась положительная реакция агглютинации.

10.2. Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови кроликов

Титры вибриоцидных антител определяют со штаммами V. cholerae биовара эльтор М-800 серовара Огава и М-879 серовара Инаба.

Исследуемые сыворотки крови кроликов разводят 1:10 0,9%-м раствором натрия хлорида, инактивируют в водяной бане при температуре 56°С в течение 30 мин для разрушения комплемента. В качестве положительного контроля используют сыворотку диагностическую холерную О1 (ОСО 42-28-26-84П). Микротитровальные пластины помещают в кювету. Начиная со второй лунки микропланшета микродозатором вносят во все лунки по 1 капле (0,05 мл) 0,9%-го раствора натрия хлорида, затем в первые и вторые лунки каждого ряда - по 1 капле испытуемых сывороток в разведении 1:10. Сыворотки титруют со второй лунки до седьмой, перенося по одной капле, после перемешивания из последней лунки одну каплю удаляют. Получают разведения сывороток от 1:10 до 1:640 (7 лунка). В 8 лунке контроль - 1 капля 0,9%-го раствора натрия хлорида и 1 капля взвеси вибрионов с концентрацией 1 x 10(8) м.к./мл.

Штаммы холерных вибрионов выращивают в течение 3 ч на свежеприготовленных пластинах щелочного агара (ФСП 42-0010-2989-02 или ФСП 42-0026-2132-01) при температуре (37 +- 1)°С. Культуры смывают охлажденным 0,9%-м раствором натрия хлорида, готовят взвеси концентрацией 2 х 10(9) вибрионов/мл, эквивалентные ОСО 42-28-85П 10 единиц, затем разводят до концентрации 1 х 10(8) м.к./мл. Пробирки с микробными взвесями каждого штамма помещают в ванночку со льдом. Затем к 5 мл взвеси каждой культуры добавляют 5 мл комплемента и тщательно перемешивают. Для этого используют стандартный комплемент сухой, разведенный до рабочего титра, или свежеприготовленную сыворотку крови морской свинки в разведении 1:20.

Для проверки правильности приготовления концентрации вибрионов каждую культуру холерных вибрионов V. cholerae биовара эльтор М-800 серовара Огава и М-879 серовара Инаба разводят отдельной стерильной пипеткой последовательно десятикратно до концентрации 1 х 10(3) м.к./мл. Затем из каждой взвеси вибрионов с концентрацией 1 x 10(3) м.к. отдельными пипетками высевают по 0,1 мл на пластинки с питательным агаром в чашки Петри и равномерно распределяют по поверхности агара покачиванием. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 18 - 24 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний. Высев на чашку с агаром делают дважды: до и после часовой инкубации культур при температуре 37°С. В первом случае высев делают для уточнения количества живых вибрионов во взвеси, во втором - количества подросших вибрионов.

Охлажденную смесь культуры и комплемента вносят микродозатором по одной капле во все лунки микротитровальной пластины с исследуемыми образцами сыворотки. Микропланшеты плотно закрывают крышками и помещают во влажную камеру (плотно закрытая кювета с чашкой Петри, в которую помещена вата, смоченная 0,9%-м раствором натрия хлорида) на 1 ч при температуре 37°С. Затем во все лунки микропланшета пипеткой объемом 5 мл закапывают по 2 капли бульона сердечной мышцы рН 7,6. Микропланшеты закрывают крышками, кювету помещают в термостат при температуре 37°С на 3 ч, после чего микропланшеты просматривают в проходящем свете на темном фоне. Отмечают лунки, где бульон стал прозрачным (имеются вибриоцидные антитела) и где есть рост вибрионов (вибриоцидные антитела отсутствуют). Окончательный учет результатов проводят через 16 - 20 ч дополнительной инкубации пластин при температуре 4°С.

За титр вибриоцидных антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором отмечалось вибриоцидное действие (лизис культуры). В посевах контрольных взвесей без дополнительной инкубации должно вырасти не менее 30 колоний, после дополнительной инкубации это количество должно увеличиться не менее чем на 30%.

Результаты исследований отражают в таблице.

Дозы для иммунизации (м.к./мл)	Сроки после введения (дни)	Титры вибриоцидных антител (обратные значения средних геометрических титров и количество позитивных сывороток)
		V. cholerae M-800		V. cholerae M-879
		Количество серопозитивных сывороток Х +- m	Количество серонегативных сывороток Х +- m	Количество серопозитивных сывороток Х +- m	Количество серонегативных сывороток Х +- m
До иммунизации
5 х 107	3
	7
	14
	28
5 х 109	3
	7
	14
	28
5 х 1010	3
	7
	14
	28
Контроль с сывороткой холерной O1

10.3. Определение титров антитоксических антител в сыворотке крови кроликов

Титры антитоксических антител определяют по их нейтрализующей активности в отношении холерного энтеротоксина (ОСО 42-28-75-83П токсина холерного жидкого).

Предварительно токсин холерный жидкий титруют на взрослых кроликах по Крейгу с целью определения минимальной дозы, вызывающей образование папулы диаметром 10 мм и толщиной складки при измерении штангенциркулем 7 - 8 мм.

Исследуемые сыворотки иммунизированных кроликов разводят сначала в 2 раза, затем последовательно двукратно, получая разведения от 1:4 до 1:128 в объеме 0,2 мл. В каждое разведение сыворотки вносят по 0,2 мл раствора, содержащего по 2 кожные дозы токсина холерного. Для контроля используют: смесь 0,2 мл нормальной кроличьей сыворотки и 0,2 мл указанного выше раствора токсина холерного (2 кожные дозы) и смесь 0,2 мл ОСО-42-28-83П сыворотки антихолерогенной, содержащей 2 антитоксические единицы, с 0,2 мл раствора токсина холерного, содержащего 2 кожные дозы. Пробирки встряхивают, выдерживают 1 ч при температуре 37°С и затем вводят по 0,1 мл в депиллированную кожу кролика. Учет результатов проводят через 24 ч после внутрикожного введения. За положительную реакцию принимают отсутствие зоны отека или наличие ее размером менее 5 мм. В контроле зона отека должна быть размером 5 - 10 мм.

За титр испытуемой сыворотки принимают ее наибольшее разведение, при котором наблюдается нейтрализация действия токсина (зона отека отсутствует или меньше 5 мм).

Результаты исследования отражают в таблице.

Иммунинизирующие дозы (в м.к./мл)	Общее число проб	Из них проб с титрами антитоксических антител						Титры антитоксических антител (Х +- m) (обратные значения средних геометрических титров)
		1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
До иммунизации
5 х 10(7)
5 х 10(9)
5 х 10(10)
Контроль токсина
Контроль токсин +ОСО антихолерогенной сыворотки

10.4. Определение копроантител

Для определения копроантител (кишечных) используют метод иммунофлуоресценции. Из взвесей трех штаммов холерных вибрионов V. cholerae 569B классического биовара серовара Инаба, V. cholerae M-3122 биовара эльтор серовара Огава и М-879 биовара эльтор серовара Инаба с концентрацией 1 х 10(9) м.к./мл готовят мазки на предметных стеклах, сушат их, фиксируют 96° спиртом в течение 20 мин. Содержимое кишечника или соскоб со слизистой оболочки тонкого кишечника разводят 1:5 0,9%-м раствором натрия хлорида, центрифугируют для удаления механических частиц и титруют с шагом 2 до разведения 1:256. По 1 капле каждого разведения наносят на предметное стекло с мазками штаммов холерных вибрионов и выдерживают 20 мин во влажной камере. Затем препарат осторожно промывают 3 раза забуференным 0,9%-м раствором натрия хлорида и дистиллированной водой, высушивают и наносят иммуноглобулины, специфичные к глобулинам кролика, меченные FITC или флуоресцеином. Предметное стекло с мазками помещают во влажную камеру на 20 мин. После окрашивания мазки промывают, как указано выше, высушивают и просматривают с помощью люминесцентного микроскопа. При наличии копроантител холерные вибрионы в мазке приобретают ярко-зеленое свечение.

Результаты исследований отражают в таблице.

Иммунизирующие дозы (в м.к./мл)	Штаммы	Общее число проб	Из них проб с титрами копроантител					Титры копроантител (Х +- m) (обратные значения средних геометрических титров)
			< 1:8	1:8	1:16	1:32	1:64
До иммунизации
5 х 10(7)	569В
	Р-3122
	М-879
5 х 10(9)	569В
	Р-3122
	М-879
5 х 10(10)	569В
	Р-3122
	М-879

За титр копроантител принимают наибольшее разведение исследуемой пробы, при котором наблюдалось ярко-зеленое свечение холерных вибрионов.