Приложение 9 (обязательное). 9. Определение стабильности биологических свойств вакцинного штамма холерного вибриона

Приложение 9
(обязательное)

9. Определение стабильности биологических свойств вакцинного штамма холерного вибриона

Методика подготовки испытуемого штамма для данных испытаний аналогична описанной в прилож. 3.

9.1. Определение стабильности штамма холерного вибриона на кроликах-сосунках

Для определения стабильности свойств вакцинного штамма проводят серию из 10 последовательных пассажей на жидких и плотных питательных средах и 10 последовательных пассажей через организм крольчат-сосунков. Крольчатам первого пассажа вводят внутрикишечно три дозы (10(3), 10(5) и 10(7) вибрионов). Каждую дозу вводят 3 крольчатам. Методика пассирования приведена в прилож. 4. Далее пассажи ведут двумя методами: заражают крольчонка содержимым кишечника предыдущего животного или вводят культуру, выделенную на питательных средах от животного предыдущего пассажа. Культуры, выделенные от животного последнего пассажа, изучают по всем культурально-морфологическим, биохимическим свойствам, безвредности и атоксигенности для кроликов, генетической стабильности (на соответствие с паспортными данными) по схеме, изложенной в прилож. 1 - 6.

9.2. Изучение стабильности свойств вакцинного штамма методом популяционного анализа

На пластинки питательного агара (по МУК 4.1/4.2.588-96) отсевают 3 линии культуры: после 10 пассажей на крольчатах-сосунках, после 10 пересевов на питательных средах и исходную лиофильно-высушенную из ампул. По 100 изолированных колоний каждой линии снимают и суспендируют каждую в своей лунке репликатора, после чего пересевают методом отпечатков сначала на пластинку с питательным агаром, затем на пластинку с агаром, содержащим антибиотики-маркеры изучаемых свойств (например, канамицин 50 мкг/мл и триметоприм 100 мкг/мл). Генетическую стабильность испытуемых субкультур оценивают по количеству клеток, сохранивших генетические маркеры. Разброс в количестве выросших колоний всех трех линий не должен превышать 10%. Наличие в популяции 90% клеток, сохранивших генетические маркеры, свидетельствуют о стабильности генома испытуемого штамма.