Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Приложение 2
(обязательное)
Определение отсутствия у вакцинного штамма холерного вибриона функционально полноценного гена, кодирующего синтез токсинкорегулируемых пилей адгезии, методом ПЦР
Токсинкорегулируемые пили адгезии (ТКПА) являются основным фактором колонизации тонкого кишечника.
Отсутствие гена, кодирующего синтез токсинкорегулируемых пилей адгезии, определяют с помощью тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae ctxA tcpA методом полимеразной цепной реакции, производства Научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны Российской Федерации.
1. Подготовка растворов и реагентов
1.1. Буферный раствор для электрофореза рН 8,3 готовят в колбе на 1 л (ГОСТ 1770-74Е) по следующей прописи:
трис-HCl (ТУ 6-09-2477-88) |
- |
14 г; |
борная кислота (ГОСТ 9656-95) |
- |
5,5 г; |
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль, ГОСТ 10652-73) |
- |
0,93 г; |
этидия бромид (Serva, Германия) |
- |
0,5 г. |
Буферный раствор хранят в темной полипропиленовой посуде при температуре (4 +- 2)°С до 30 сут.
1.2. Буфер для нанесения ПЦР-проб на гель. 0,025 г бромфенолового синего (ТУ-6-09-1058-86), 0,7 г сахарозы (ГОСТ 5833-95) и 0,5 г глицерина (ГОСТ 6259-95) помещают в химический стакан на 25 мл (ГОСТ 25336-82Е), растворяют в 5 мл дистиллированной воды, после чего доводят общий объем раствора до 10 мл дистиллированной водой. Буфер хранят в стеклянной посуде при температуре 18 - 22°С до 3 мес. 1.3 - 0,9%-й раствор натрия хлорида. Навеску 9 г натрия хлорида (ГОСТ 4233-77) помещают в мерную колбу на 1 л (ГОСТ 1770-74Е), добавляют 100 мл дистиллированной воды. После полного растворения доводят дистиллированной водой до 1 л. Раствор фильтруют, устанавливают с помощью натрия двузамещенного фосфорнокислого рН 7,2 +- 0,1, разливают во флаконы (ГОСТ 10782-77) и стерилизуют при (120 +- 2)°С в течение 30 мин. Раствор хранят при температуре 18 - 22°С до 3 мес.
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
1.4. 0,1%-й раствор натрия мертиолята. Навеску натрия мертиолята 0,1 г помещают в мерную колбу на 100 мл (ГОСТ 1770-74Е), добавляют 50 мл дистиллированной воды, после полного растворения соли доводят дистиллированной водой до 100 мл. Оценку качества раствора натрия мертиолята проводят по МУК 4.1/4.2.588-96. С. 105.
2. Подготовка испытуемого и контрольных штаммов холерного вибриона
2.1. Для получения микробной взвеси испытуемого и контрольных штаммов, в качестве которых используют штаммы V. cholerae 569B ctxA tcpA классического биовара и V. cholerae М-1273 ctxA tcpA биовара эльтор, ампулы с лиофилизированными культурами стерильно вскрывают и вносят в них 0,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида мерной пипеткой емкостью 1 - 2 мл II класса точности по ГОСТ 20292-74. После растворения каждую микробную взвесь в объеме 0,1 мл засевают с помощью этой же пипетки в бульон Хоттингера рН 7,6 +- 0,1 и инкубируют в течение 3 - 6 ч при температуре (37 +- 1)°С. Затем производят высев с помощью бактериальной петли N 2 на агар Хоттингера рН 7,6 +- 0,1 и инкубируют при температуре (37 +- 1)°С в течение 18 - 20 ч.
2.2. Получение ДНК. Взвесь односуточной культуры изучаемого и контрольных штаммов, выращенных на агаре Хоттингера рН 7,6 +- 0,1, готовят в 2 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида по стандартному образцу мутности 5 единиц (ОСО 42-28-86П), что соответствует 1,1 х 10(9) вибрионов в 1 мл. Затем делают 10-кратные разведения взвесей (0,5 мл взвеси и 4,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида) до концентрации 1 х 10(5), 1 х 10(4) и 1 х 10(3) м.к./мл. Количество клеток проверяют высевом 0,1 мл из разведения с концентрацией 1 х 10(3) м.к./мл на агар Хоттингера рН 7,6 +- 0,1. Через 24 ч инкубации в термостате при температуре (37 +- 1)°С подсчитывают количество выросших колоний (на агаровых пластинках должно вырастать не менее 30 колоний) и количество м.к. в 1 мл культуры, умножив полученную величину на разведение.
Для обеззараживания микробных взвесей, содержащей 1 х 10(5), 1 х 10(4) и 1 х 10(3) м.к./мл, добавляют 0,1%-й раствор мертиолята натрия до конечной концентрации 0,01% (1:10 000) и прогревают на водяной бане при температуре (56 +- 1)°С в течение 30 мин согласно МУ 3.5.5.1034-01 (п. 5.1.1). После этого работа может проводиться как с обеззараженным материалом.
2.3. Выделение ДНК. Выделение ДНК следует проводить в соответствии с п. 4 прилож. 1.
3. Проведение полимеразной цепной реакции
Исследование приготовленной пробы с праймерами N 1 и N 2 (обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК размером 302 п. н., соответствующего нуклеотидной последовательности структурного гена ctxА), N 3, N 4 и N 5 (обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК размером 455 п. н. для V. cholerae О1 биовара эльтор и V. cholerae О139, а также размером 264 п.н. для V. cholerae О1 классического биовара) проводят параллельно в отдельных пробирках.
Реактивы для проведения реакции извлекают из морозильника и полностью размораживают при комнатной температуре.
Для проведения амплификации ДНК используют микроцентрифужные пробирки объемом 0,6 мл (полипропиленовые, "QSP", США). Пробу ставят в трех повторностях. Все реакционные компоненты добавляют отдельными наконечниками ("Ленпипет", РФ) с помощью автоматических микропипеток на 10, 40 и 200 мкл ("Лабсистем-Ленпипет", РФ).
Готовят смесь компонентов для анализа в микроцентрифужных пробирках с праймерами N 1 и N 2 из расчета на одну пробу в следующей последовательности: Н2О деионизированную - 12,5 мкл, 10 х Б - 2,5 мкл, дНТФ - 2,5 мкл, раствор праймеров (N 1, N 2) - 2 мкл, Taq-полимераза - 0,5 мкл. После добавления всех компонентов реакционную смесь тщательно перемешивают путем пипетирования и разливают по 20 мкл в микропробирки объемом 0,5 мл. В микропробирку с отрицательным контролем добавляют вместо ДНК-пробы по 5 мкл деионизированной воды. В пробирки с положительным контролем добавляют по 5 мкл раствора ДНК, разведенного в 10, 100, и 1 000 раз (выделенного из контрольных штаммов холерного вибриона в дозах 1 х 10(3), 1 х 10(4) м.к./мл). В остальные микропробирки добавляют по 5 мкл раствора ДНК, выделенного из испытуемого штамма холерного вибриона в дозах 1 х 10(3), 1 х 10(4) и 1 х 10(9) м.к./мл. На поверхность смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. Общий объем реакционной смеси во всех микропробирках должен составлять 25 мкл. Микропробирки закрывают.
Смесь компонентов для анализа с праймерами N 3, N 4 и N 5 готовят аналогично описанному выше для праймеров N 1 и N 2 с тем отличием, что вместо праймеров N 1 и N 2 вносят праймеры N 3, N 4 и N 5.
Микропробирки помещают в ячейки рабочей камеры программируемого термостата (амплификатор "Терцик МС-2", РФ). Перед началом амплификации ДНК в исследуемых пробах денатурируют при температуре (94 +- 0,1)°С в течение 5 мин. Затем проводят 35 циклов ПЦР. Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК при температуре 94°С в течение 1 мин, гибридизацию праймеров на ДНК-матрице при температуре 51°С (при анализе с праймерами N 1 и N 2) или 53°С (при анализе с праймерами N 3, N 4 и N 5) в течение 1 мин, синтез комплементарной цепи ДНК при температуре 72°С в течение 1 мин. После последнего цикла пробирки прогревают в течение 10 мин при температуре (72 +- 0,1)°С.
4. Постановка гель-электрофореза. Продукты ПЦР анализируют методом гель-электорфореза в 2%-й агарозе в аппарате типа ПГ-9 или "Sub-Cell GT" (BIO-RAD, США) с блоком питания и набором штампов для подготовки геля.
4.1. Для подготовки 2%-го агарозного геля используют буферный раствор для электрофореза: к 2 г агарозы ("Серва", Германия, или "SIGMA", США) добавляют 100 мл буферного раствора для электрофореза. Смесь в термостойкой колбе нагревают в кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, охлаждают до температуры 50°С и выливают на подготовленный столик аппарата типа ПГ-9 или "Sub-Cell GT" для заливки геля с установленной гребенкой для формирования лунок. Размеры столика соответственно (9 х 13) см или (10 х 15) см; высота слоя геля, образующегося при указанных условиях - 4 мм. С помощью специального штампа "гребенки" на катодном конце геля формируют лунки для нанесения проб. Между дном лунки и основанием геля должен оставаться слой агарозы 0,5 - 1,0 мм. Гребенку осторожно удаляют, платформу с гелем устанавливают в прибор для электрофореза.
Буферные емкости аппарата ПГ-9 заполняют ТАЕ буфером - 500 мл, при этом он покрывает гель слоем 3 - 5 мм, а аппарата "Sub-Cell GT" - слоем буфера 2 - 3 мм.
4.2. Проведение гель-электрофореза. К 20 мкл амплифицированного продукта добавляют 3 мкл буферного раствора для нанесения проб. Образцы вносят с помощью автоматической микропипетки переменного объема от 20 до 40 мкл в лунки геля под буферный раствор для электрофореза. Электрофорез проводят при градиенте напряжения 10 В/см в течение 1 ч, пока красителю остается пройти до анодного края геля не менее 2 см.
Окрашенную бромистым этидием ДНК в геле просматривают под ультрафиолетовым излучением, для чего используют УФ трансиллюминатор "LKB 2011" фирмы "LKB" (Швеция) или трансиллюминатор "ФЛУСКОП-2" ("Диа-М", Россия) с длиной волны 305 нм. Гель фотографируют в проходящем свете на фотопленку "Микрат-300" или "ФР-64" ("Тасма", РФ) и сканируют с использованием документирующей системы Gel Doc 1000 (BIO-RAD, США).
4.3. Учет результатов ПЦР. Результаты оцениваются по отсутствию или наличию у испытуемого штамма фрагментов ДНК, полосы которых располагаются в геле на том же уровне, что и полосы у положительных контролей. В положительном контроле с контрольным препаратом ДНК из клеток V. cholerae 569B классического биовара и V. cholerae М-] 273 биовара эльтор в концентрации 10(4) и 10(3) м.к./мл при использовании праймеров N 1 и N 2 должен присутствовать один фрагмент (полоса) величиной 302 п. н., соответствующий нуклеотидной последовательности структурного гена ctxA, ответственного за синтез субъединицы А холерного токсина. В положительном контроле при использовании праймеров N 3, N 4 и N 5 должны быть видны два фрагмента ДНК размером 455 п.н. (для V. cholerae О1 биовара эльтор и 0139) и 264 п. н. (для V. cholerae О1 классического биовара), соответствующие нуклеотидным последовательностям структурного гена tcpA, ответственного за синтез основной субъединицы пилей адгезии. Отсутствие продукта реакции оценивается как отрицательный результат.
Вакцинный штамм холерного вибриона в концентрации 1 x 10(5), 1 x 10(4), 1 x 10(3) м.к./мл не должен давать полосы в геле, идентичные положительным контролям.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.