Методические указания МУК 4.1.766-99 "Газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, N-метиланилин, о-толуидин, N,N-димeтилaнилин, N-этиланилин, N,N-диэтилaнилин) в биосредах (моча)" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Методические указания МУК 4.1.766-99
"Газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, N-метиланилин, о-толуидин, N,N-димeтилaнилин, N-этиланилин, N,N-диэтилaнилин) в биосредах (моча)"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Дата введения: 6 сентября 1999 г.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений" и ГОСТа Р1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение ароматических аминосоединений в моче в диапазоне концентраций:

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 1.5-2012 "Стандартизация в Российской Федерации. Стандарты национальные. Правила построения, изложения, оформления и обозначения", утвержденный приказом Росстандарта от 23 ноября 2012 г. N 1147-ст

     анилин                 0,045-2,0 мкг/см3

     N-метиланилин          0,060-3,2 мкг/см3

     о-толуидин             0,040-4,2 мкг/см3

     N,N-диметиланилин      0,050-5,2 мкг/см3

     N-этиланилин           0,045-3,0 мкг/см3

     N,N-диэтиланилин       0,150-5,2 мкг/см3

Особенностью токсического действия ароматических аминосоединений являются функциональные нарушения центральной нервной системы, печени. Ароматические аминосоединения вызывают дерматиты, экземы и развитие аллергии.

АНИЛИН                                                 Мол. масса - 93,12

C6H5NH2

Анилин - маслянистая прозрачная светло-желтая жидкость со специфическим запахом. Т_кип - 184,4°С, Т_плавл - минус 5,89°С. Анилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. Анилин относится ко 2 классу опасности.

N-МЕТИЛАНИЛИН                                         Мол. масса - 107,50

C6H5NHCH3

N-метиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 195,7°С,Тплавл- минус 57,0°С. N-метиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-метиланилин относится к 3 классу опасности.

О-ТОЛУИДИН                                            Мол. масса - 107,15

C6H4NH2CH3

О-толуидин - маслообразная прозрачная жидкость от светло-желтого до красновато-коричневого. Т_кип - 199,7°С, Т_плавл - минус 24,4°С. О-толуидин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. О-толуидин относится ко 2 классу опасности.

N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН                                      Мол. масса- 121,18

C6H5N(CH3)2

N,N-диметиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 194,0°С, Т_плавл -2,45°С. N,N-диметиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диметиланилин относится ко 2 классу опасности.

N-ЭТИЛАНИЛИН                                           Мол. масса - 121,1

C6H5NC2H5

N-этиланилин - маслянистая прозрачная жидкость с желтым оттенком со специфическим запахом. Т_кип - 204,7°С. N-этиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-этиланилин относится к 4 классу опасности.

N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН                                      Мол. масса - 149,23

C6H5N(C2H5)2

N,N-диэтиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 216,27°С. Т_плавл - минус 38,8°С. N,N-диэтиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диэтиланилин относится к 4 классу опасности.

ДИФЕНИЛ                                               Мол. масса - 154,21

С6Н5С6Н3

Дифенил - бесцветные кристаллы. Т_кип - 255,9°С, Т_плавл - 71,0°С. Дифенил не растворим в воде, растворим в органических растворителях.

ХЛОРОФОРМ                                             Мол. масса - 119,38

СНCl3

Хлороформ - бесцветная жидкость с характерным сладковатым запахом. Т_кип - 61,15°С, Т_плавл - минус 63,5°С. Хлороформ растворим в этаноле, эфире, бензоле, ацетоне и сероуглероде, малорастворим в воде. Хлороформ относится ко 2 классу опасности.

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений:

     анилин                    12,4%,

     N-метиланилин             11,8%,

     о-толуидин                15,0%,

     N,N-диметиланилин         10,0%,

     N-этиланилин              21,42%,

     N,N-диэтиланилин          15,4%

при доверительной вероятности 0,95.

Сущность метода

Методика основана на предварительном концентрировании анализируемых соединений из биологического материала экстракцией хлороформом и последующего газохроматографического анализа хлороформенного экстракта.

Измерение концентрации ароматических аминосоединений выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.

Нижний предел измерения в объеме пробы:

     анилин                     0,045 мкг,

     N-метиланилин              0,060 мкг,

     о-толуидин                 0,040 мкг,

     N,N-диметиланилин          0,050 мкг,

     N-этиланилин               0,045 мкг,

     N,N-диэтиланилин           0,050 мкг.

Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды и алифатические спирты. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 40 мин.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными метрологическими характеристиками.

Средства измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические		ГОСТ 24104-80Е

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания", утвержденный приказом Ростехрегулирования от 25 декабря 2008 г. N 739-ст

Секундомер "Агат"		ГОСТ 5072-79Е
Микрошприцы МШ-10		ТУ5Е2.833.106
Посуда лабораторная стеклянная		ГОСТ 1770-84
Колбы мерные, вместимостью 100, 1000 см3		ГОСТ 1770-74Е
Пипетки, вместимостью 1, 5, 10 см3		ГОСТ 20292-74
Воронка делительная		ГОСТ 23932-79

Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм
Бидистиллятор		ГОСТ 15150-69
Редуктор кислородный		ТУ 26-05-235-70
Ротационный испаритель типа ИР-1,
ИР-1М или аналогичный
Центрифуга СМ-4, 3000 об/мин

Материалы

Гелий в баллоне		ТУ 51- 940-80
Водород технический		ГОСТ 3022-80
Воздух в баллоне		ГОСТ 11882-73

Реактивы

3% OV-1 на хроматоне N-супер фракции 0,16-0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки
Анилин ч. д. а.		ГОСТ 5810-78
N-метиланилин технический		ТУ 6-02-571- 81
N,N-диметиланилин ч. д. а.		ГОСТ 5855-78
О-толуидин ч. д. а.		ГОСТ 10205-73
N-этиланилин технический		ТУ 6214-12-37-77
N,N-диэтиланилин ч. д. а.		ГОСТ 10162-75
Дифенил ч. д. а.
Вода дистиллированная		ГОСТ 6709-72
Хлорид натрия х. ч.		ГОСТ 4233
Хлороформ фарм.		ГОСТ 20015-88

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 12.1.004-85 постановлением Госстандарта СССР от 14 июня 1991 г. N 875 с 1 июля 1992 г. введен в действие ГОСТ 12.1.004-91

При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивом соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе.

Условия измерений

При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20+-5)°С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 80% при температуре 25°С.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в

условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Приготовление стандартных смесей

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую исследуемых компонентов, и готовят серию рабочих стандартных растворов.

Стандартные растворы аминосоединений и внутреннего стандарта готовят в мерных колбах вместимостью 100 см3 с содержанием этих веществ 20, 30, 50, 60, 70 мг и дифенила с содержанием 100, 90, 70, 60, 50 мг в хлороформе.

Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 55 см3/мин при температуре 300°С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом внутреннего стандарта (в качестве внутреннего стандарта - дифенил). Она выражает зависимость калибровочных коэффициентов (Ki/ст) от отношения площадей пиков на хроматограмме (Si/S_ст) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Для этого в каждую колбу вместимостью 100 см3 вносят небольшое количество хлороформа и взвешивают, затем прибавляют аминосоединения и внутренний стандарт и взвешивают колбу повторно. Объем доводят до метки хлороформом и по разности результатов первого и второго взвешиваний вычисляют массу аминосоединений и внутреннего стандарта. Срок хранения - 3 ч.

Таблица

Стандартные растворы для установлении градуировочной характеристики при определении концентрации аминосоединений (фрагмент шкалы)

Номер смеси для градуировки	1	2	3	4	5
Масса АНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N-МЕТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса О-ТОЛУИДИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N-ЭТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N,N-ДИЭТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса ДИФЕНИЛА в 10 мм3 хлороформа, мкг	10,0	9,0	7,0	6,0	5,0

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 мм3 каждого стандартного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок	110°С,
температура испарителя	180°С,
температура детектора	120°С,
скорость программирования температуры	3°С/мин,
расход газа-носителя (гелия)	55 см3/мин,
расход водорода	33 см3/мин,
расход воздуха	300 см3/мин,
шкала измерителя тока	10х10(-12) А,
скорость диаграммной ленты	240 мм/ч,
время удерживания: хлороформа	1 мин 45 с,
анилина	6 мин 15 с,
N-метиланилина	9 мин,
о-толуидина	9 мин 15 с,
N,N-диметиланилина	9 мин 50 с,
N-этиланилина	11 мин,
N,N-диэтиланилина	20 мин,
дифенила	37 мин.

На хроматограмме находят значения площадей пиков и внутреннего стандарта и вычисляют калибровочные коэффициенты на основании анализа бинарных смесей: анилин-дифенил, N-метиланилин-дифенил, о-толуидин-дифенил, N,N-диметиланилин-дифенил, N-этиланилин-дифенил и N,N-диэтиланилин-дифенил. Значение калибровочного коэффициента вычисляют по формуле:

                    Scm x Qi

           Ki/cm = ----------, где

                    Si x Qcm

     Si,Scm -площади пиков исследуемого компонента и стандарта, мм2;

     Qi,Qcm - количество исследуемого компонента и стандарта, мг.

По результатам 5 измерений определяется среднее значение калибровочного коэффициента Ki/cm и строится градуировочный график в координатах калибровочный коэффициент-отношение площадей пиков Si/Scm.

Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.

Отбор проб

Отбор проб мочи в объеме 100 см3 производится в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

Выполнение измерений

Анализируемую пробу мочи в количестве 100 см3 помещают в делительную воронку, добавляют 30 г (хлорид натрия) и 10 см3 хлороформа. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 15 мин, после отстаивания хлороформенный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 20 мин. Полученный центрифугат упаривают на ротационном испарителе и проводят газохроматографический анализ.

Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации анилина, N-метиланилина, о-толуидина, N,N-диметиланилина, N-этиланилина, N,N-диэтиланилина (мкг/см3) в биопробе вычисляют по формуле :

                   Si x m  x Ki/cm x 1000

                         cm

              С = -----------------------, где

                         S   x V

                          cm

     С - концентрация анализируемых соединений в биопробе, мкг/см3;

     Si, Scm - площади пиков компонентов и стандарта, мм2;

     Ki/cm - калибровочный коэффициент;

     m   - навеска стандарта, мг;

      cm

     К - объем пробы, см3.

Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

ГАРАНТ:

Взамен МИ 2335-95 Госстандартом России введена в действие с 1 октября 2003 г. рекомендация МИ 2335-2003

Контроль сходимости выходных сигналов

Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений.

Результат контроля признается положительным при выполнении условия:

            S    - S

             max    min

           ------------- x 100 <= 15%, где

                -

                S

     S - площадь пика, мм2;

     -

     S - среднее арифметическое  значение  площади  пиков   при   вводе 3

параллельных проб градуировочного раствора.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50-150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой Х'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                  |Х' - Х - С| < К , где

                                  д

     С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией, мкг/см3;

     К  - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см3.

      д

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают

                                     2           2

                К  = кв.корень Дельта х' + Дельта х, где

                 д

           2           2

     Дельта х' и Дельта х - характеристики   погрешностей   для  исходной

пробы и пробы с добавкой, мкг/см3.

            Дельта х' = 0,165 х Х' и Дельта х  = 0,165 х X

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что

                   К'  = 0,84 х К

                    д            д

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.