Методические указания МУК 4.1.767-99 "Газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, N-метиланилин, о-толуидин, N,N-диметиланилин, N-этиланилин, N,N-диэтилaнилин) в биосредах (кровь)" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Методические указания МУК 4.1.767-99
"Газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, N-метиланилин, о-толуидин, N,N-диметиланилин, N-этиланилин, N,N-диэтилaнилин) в биосредах (кровь)"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Дата введения: 6 сентября 1999 г.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений" и ГОСТа Р 1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов".

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 1.5-2012 "Стандартизация в Российской Федерации. Стандарты национальные. Правила построения, изложения, оформления и обозначения", утвержденный приказом Росстандарта от 23 ноября 2012 г. N 1147-ст

Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение ароматических аминосоединений в крови в диапазоне концентраций:

     анилин                  0,035-0,2 мкг/см3,

     N-метиланилин           0,030-0,3 мкг/см3,

     о-толуидин              0,035-4,2 мкг/см3,

     N,N-диметиланилин       0,040-0,6 мкг/см3,

     N-этиланилин            0,045-0,3 мкг/см3,

     N,N-диэтиланилин        0,075-0,3 мкг/см3.

Особенностью токсического действия ароматических аминосоединений являются функциональные нарушения центральной нервной системы, печени. Ароматические аминосоединения вызывают дерматиты, экземы и развитие аллергии.

АНИЛИН                                                 Мол. масса - 93,12

C6H5NH2

Анилин - маслянистая прозрачная светло-желтая жидкость со специфическим запахом. Т_кип - 184,4°С, Тплавл - минус 5,89°С. Анилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. Анилин относится ко 2 классу опасности.

N-МЕТИЛАНИЛИН                                         Мол. масса - 107,50

C6H5NHCH3

N-метиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 195,7°С, Т_плавл - минус 57,0°С. N-метиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-метиланилин относится к 3 классу опасности.

О-ТОЛУИДИН                                            Мол. масса - 107,15

C6H4NH2CH3

О-толуидин - маслообразная прозрачная жидкость от светло-желтого до красновато-коричневого. Т_кип - 199,7°С, Т_плавл - минус 24,4°С. О-толуидин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. О-толуидин относится ко 2 классу опасности.

N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН                                     Мол. масса - 121,18

C6H5N(CH3)2

N,N-диметиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 194,0°С, Тплавл - 2,45°С. N,N-диметиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диметиланилин относится ко 2 классу опасности.

N-ЭТИЛАНИЛИН                                            Мол. масса -121,1

C6H5NC2H5

N-этиланилин - маслянистая прозрачная жидкость с желтым оттенком со специфическим запахом. Т_кип - 204,7°С. N-этиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-этиланилин относится к 4 классу опасности.

N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН                                      Мол. масса - 149,23

C6H5N(C2H5)2

N,N-диэтиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 216,27°С. Т_плавл - минус 38,8°С. N,N-диэтиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диэтиланилин относится к 4 классу опасности.

ХЛОРОФОРМ                                             Мол. масса - 119,38

CHCl3

Хлороформ - бесцветная жидкость с характерным сладковатым запахом. Т_кип - 61,15°С, Т_плавл - минус 63,5°С. Хлороформ растворим в этаноле, эфире, бензоле, ацетоне и сероуглероде, малорастворим в воде. Хлороформ относится ко 2 классу опасности.

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений:

     анилин                           18,1%,

     N-метиланилин                    14,8%,

     о-толуидин                       15,0%,

     N,N-диметиланилин                12,9%,

     N-этиланилин                     13,5%,

     N,N-диэтиланилин                 14,5%

при доверительной вероятности 0,95.

Сущность метода

Методика основана на предварительном концентрировании анализируемых соединений из биологического материала экстракцией хлороформом и последующего газохроматографического анализа хлороформенного экстракта.

Измерение концентрации ароматических аминосоединений выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.

Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды и алифатические спирты. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 35 мин.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Средства измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические		ГОСТ 24104-80Е

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания", утвержденный приказом Ростехрегулирования от 25 декабря 2008 г. N 739-ст

Секундомер "Агат"		ГОСТ 5072-79Е
Микрошприцы МШ-10		ТУ5Е2.833.106
Посуда лабораторная стеклянная		ГОСТ 1770-84
Колбы мерные вместимостью 1000 см3		ГОСТ 1770-74Е
Пипетки вместимостью 1, 5, 10 см3		ГОСТ 20292-74
Пробирки с притертыми пробками вместимостью 10 см3		ГОСТ 1770-74Е

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "ГОСТ 1770-84" имеется в виду "ГОСТ 1770-74"

Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм
Бидистиллятор		ГОСТ 15150-69
Редуктор кислородный		ТУ 26-05-235-70
Центрифуга ОП-8УХЛ42,7000 об/мин

Материалы

Гелий в баллоне		ТУ 51-940-80
Водород технический		ГОСТ 3022-80
Воздух в баллоне		ГОСТ 11882-73

Реактивы

3% OV-1 на хроматоне N-супер фракции 0,16-0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки
Анилин ч. д. а.		ГОСТ 5810-78
N-метиланилин технический		ТУ 6-02-571- 81
N,N-диметиланилин ч. д. а.		ГОСТ 5855-78
О-толуидин ч. д. а.		ГОСТ 10205-73
N-этиланилин технический		ТУ 6214-12-37-77
N,N-диэтиланилин ч. д. а.		ГОСТ 10162-75
Хлороформ фарм.		ГОСТ 20015-88
Вода дистиллированная		ГОСТ 6709-72

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 12.1.004-85 постановлением Госстандарта СССР от 14 июня 1991 г. N 875 с 1 июля 1992 г. введен в действие ГОСТ 12.1.004-91

При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивом соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, прошедшие специализацию по работе на газовом хроматографе.

Условия измерений

При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20+-5)°С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 80 % при температуре 25°С.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Приготовление стандартных смесей

Для построения градуировочного графика собирают кровь у контрольной группы и готовят серию рабочих стандартных растворов.

Исходный стандартный раствор для градуировки: в колбу вместимостью 1000 см3 вводят по 10 см3 каждого из аминосоединений. Весовое содержание аминосоединений в исходном стандартном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): анилин - 10,22 мкг/см3, N-метиланилин - 9,86 мкг/см3, о-толуидин - 9,99 мкг/см3, N,N-диметиланилин - 9,56 мкг/см3, N-этиланилин - 9,63 мкг/см3, N,N-диэтиланилин - 9,35 мкг/см3. Срок хранения -5 ч.

Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 55 см3/мин при температуре 300°С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (мм2) от массы аминосоединений (мкг) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из 5 стандартных растворов, готовят в мерных пробирках объемом 5 см3, добавляют по 1 см3 и вносят исходный стандартный раствор в соответствии с таблицей. Срок хранения - 3 ч.

Таблица

Стандартные растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации аминосоединений (фрагмент шкалы)

Номер смеси для градуировки	1	2	3	4	5
АНИЛИН Объем исходного стандартного раствора (10,22 мкг/см3), мм3	2,0	4,0	6,0	8,0	10,0
Содержание анилина в I см3 крови, мкг/см3	0,024	0,040	0,060	0,080	0,10
N-МЕТИЛАНИЛИН Объем исходного стандартного раствора (9,863 мкг/см3), мм3	2,0	4,0	6,0	8,0	10,0
Содержание N-метиланилина в 1 см3 крови, мкг/см3	0,019	0,039	0,059	0,078	0,099
О-ТОЛУИДИН Объем исходного стандартного раствора (9,99 мкг/см3), мм3	2,0	4,0	6,0	8,0	10,0
Содержание о-толуидина в 1 см3 крови, мкг/см3	0,019	0,039	0,060	0,079	0,099
N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН Объем исходного стандартного раствора (9,56 мкг/см3), мм3	2,0	4,0	6,0	8,0	10,0
Содержание N,N-диметиланилина в 1 см3 крови, мкг/см3	0,019	0,038	0,057	0,076	0,095
N-ЭТИЛАНИЛИН Объем исходного стандартного раствора (9,626 мкг/см3), мм3	2,0	4,0	6,0	8,0	10,0
Содержание N-этиланилина в 1 см3 крови, мкг/см3	0,019	0,038	0,058	0,077	0,096
N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН Объем исходного стандартного раствора (9,35 мкг/см3), мм3	2,0	4,0	6,0	8,0	10,0
Содержание N,N-диэтиланилина в 1 см3 крови, мкг/см3	0,019	0,037	0,056	0,075	0,094

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 мм3 каждого стандартного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок	110°С,
температура испарителя	180°С,
температура детектора	120°С,
расход газа-носителя (гелия)	55 см3/мин,
расход водорода	33 см3/мин,
расход воздуха	300 см3/мин,
шкала измерителя тока	10 х 10(-12) A,
скорость диаграммной ленты	240 мм/ч,
время удерживания: хлороформа	1 мин 45 с,
анилина	6 мин 15 с,
N-метиланилина	9 мин,
о-толуидина	9 мин 15 с,
N,N-диметиланилина	9 мин 50 с,
N-этиланилина	11 мин,
М,М-диэтиланилина	20 мин,

Пробы крови, содержащие различные концентрации анализируемых соединений, экстрагируют 2 см3 хлороформа с последующим кипячением в течение 15 с. Белок удаляют центрифугированием при 7000 об/мин. Полученные экстракты хроматографируют при определенной чувствительности прибора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков аминосоединений и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику.

Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.

Отбор проб

Отбор проб венозной крови в объеме 10 см3 производится в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой. Анализ крови проводить сразу или хранить в холодильнике не более 5 суток.

Выполнение измерений

Пробы, содержащие 1 см3 крови, экстрагируют 2 см3 хлороформа с последующим кипячением в течение 15 с. После удаления белков центрифугированием при 7000 об/мин в течение 15 мин проводят количественное определение анализируемых соединений в подготовленных пробах по калибровочному графику.

Вычисление результатов измерений

Количественное определение (С) проводят методом абсолютной калибровки (мкг/см3). Расчет концентраций аминосоединений проводят по формуле:

                      A x V

                           хл

              C = ---------------, где

                   V x V  x 1000

                    1   2

     А - количество компоненты, найденное по калибровочному графику, мкг;

     V  - объем экстрагента, см3.

      хл

     V  - объем экстрагируемой жидкости, см3.

      1

     V  - объем хроматографируемой пробы, мм3.

      2

Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

ГАРАНТ:

Взамен МИ 2335-95 Госстандартом России введена в действие с 1 октября 2003 г. рекомендация МИ 2335-2003

Контроль сходимости выходных сигналов

Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений.

Результат контроля признается положительным при выполнении условия:

            S    - S

             max    min

           ------------- x 100 <= 15%, где

                -

                S

     S - площадь пика, мм2;

     -

     S - среднее арифметическое  значение  площади  пиков   при   вводе 3

параллельных проб градуировочного раствора.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 - 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т. е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                  |Х' - Х - С| < К , где

                                  д

     С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией, мкг/см3;

     К  - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см3.

      д

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают

                                     2           2

                К  = кв.корень Дельта х' + Дельта х, где

                 д

           2           2

     Дельта х' и Дельта х - характеристики   погрешностей   для  исходной

пробы и пробы с добавкой, мкг/см3.

            Дельта х' = 0,165 х Х' и Дельта х  = 0,165 х X

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что

                   К'  = 0,84 х К

                    д            д

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.