Приложение 2. Методические указания МУК 4.2.2304-07 "Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения"

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах.

1.2. Представлены скрининговые методы, направленные на выявление и количественное определение рекомбинантной ДНК: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты, терминатора NOS из Agrobactetium tumefaciens и маркерных генов, позволяющие проводить предварительную проверку пищевой продукции.

1.3. Представлены методы, направленные на идентификацию и количественное определение рекомбинантной ДНК, характерной для генетических конструкций и уникальных трансформационных событий, для осуществления окончательной идентификации линии ГМО растительного происхождения.

2.1. Для проведения идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения используется следующая аппаратура и инструменты:

- амплификаторы типа ABI Prism 7000, iCycler iQ, Rotor Gene - 3000 (6000), AHK-32, "Терцик МС-2" и другие;

- комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа "ДЕРМИГЕН-001";

- прибор для горизонтального электрофореза типа "Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок;

- источник напряжения типа "Power Pac 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50 - 300 В;

- трансиллюминатор типа Т12 с защитным экраном, диапазон излучения 300 - 400 нм;

- видеосистема типа "Gel Doc 2000(Т.М)", предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию);

- холодильник бытовой электрический типа "Электролюкс", с температурой морозильной камеры минус 20°C;

- микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 13000 мин.(-1));

- термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15°C до 120°C, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2°C, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5°C;

- термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 42°C, рабочий диапазон от 20°C до 60°C, точность поддержания температуры +- 1°C;

- аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250 - 3000 мин(-1);

- печь микроволновая (мощностью не менее 400 W);

- весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;

- анализатор потенциометрический типа МР 220, погрешность измерений pH +- 0,01;

- гомогенизатор перистальтического типа "Стомайкер" или других моделей;

- облучатель бактерицидный настенный типа ОБН-150;

- дозаторы с переменным объемом дозирования: 0,2 - 2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +- 1,2%; 0,5 - 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +- 0,8%; 2 - 20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +- 0,8%; 20 - 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +- 0,6%; 100 - 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +- 3%; 2 - 10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью +- 0,5%.

2.2. Для проведения идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения используется следующая лабораторная посуда:

- цилиндры мерные лабораторные вместимостью 10, 25, 100, 1000 мл, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 327263-2 EA, Z 327301-2 ЕА, Z 327379-2 ЕА, Z 327476-2 ЕА;

- колбы мерные лабораторные вместимостью 25, 50, 100, 250, 1000 мл, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 329517-1 EA, Z 329525-1 EA, Z 329533-1 ЕА, Z 329541-1 EA, Z 329576-1 EA;

- пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2, 0,5, 1,5 мл;

- наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до: 10; 20; 200; 1000 мкл; 10 мл.

2.3. Для проведения идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения используются следующие реактивы:

- кислота соляная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 1758;

- кислота борная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 7901;

- натрий едкий, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N 221465;

- натрий хлористый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N S 3014;

- этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Е 5134;

- гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАВ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 5882;

- трис (оксиметил) аминометан, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 6791;

- альбумин бычий сывороточный сухой (БСА), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287;

- этидий бромистый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Е 4391;

- спирт этиловый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат N 459836;

- спирт изопропиловый, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N 19516;

- хлороформ, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N 151823;

- вода деионизированная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N W 4502;

- вода дистиллированная, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N W 3500;

- 2-меркаптоэтанол, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N М 3148;

- термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70°C - 72°C, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 1806;

- буфер для ПЦР с MgCl2, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 2192;

- агароза для электрофореза (тип П), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N А 6877;

- маркер молекулярной массы ДНК, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 1473;

- стандартный образец состава генетически немодифицированного организма растительного происхождения, корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka), кат. N 53198;

- стандартный образец состава ГМО растительного происхождения, корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka), кат. N 44386;

- 2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4788;

- 2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4913;

- 2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 5038;

- 2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 9656;

- праймеры, ЗАО "Синтол" (Россия);

- натрия додецилсульфат (SDS), корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N L 4390;

- 3%-ный раствор перекиси водорода, корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N 7722.

2.4. Допускается использование другой аппаратуры, инструментов и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше отечественного и зарубежного производства, разрешенные для применения в установленном порядке.

3.1. Приготовление растворов:

- для приготовления 1М ТРИС - HCl (pH 7,5) в мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана в 80 мл дистиллированной воды, довести pH концентрированной соляной кислотой до 7,5, довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при температуре -20°C в течение не более года;

- для приготовления 5М NaCl растворить 29,22 г натрия хлористого в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года;

- для приготовления 30%-ной NaOH' растворить 3 г натрия гидроокиси в 7 мл дистиллированной воды;

- для приготовления 0,5М ЭДТА (pH 8,0) в мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты в 80 мл дистиллированной воды, раствором 30%-ной натрия гидроокиси довести pH раствора до 8,0, дистиллированной водой объем раствора довести до метки, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года;

3.2. Приготовление хлороформа, насыщенного водой:

- смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставить на 24 ч для насыщения;

- срок хранения при температуре от 4°C до 5°C - не более 6 мес.

3.3. Приготовление 70%-го раствора этилового спирта:

- смешать 70 мл 96%-го этилового спирта с 26 мл деионизированной воды;

- срок хранения при температуре от 4°C до 5°C - не более 2 мес.

3.4. Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл):

- растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды;

- срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20°C - не более 6 мес.

3.5. Приготовление лизирующего буфера (2%-ного "СТАВ"):

- растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды, добавить 2,5 мл 1M Трис - HCl, 7 мл 5М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА, довести объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешать;

- срок хранения при температуре от 4°C до 5°C - не более 6 мес.

3.6. Приготовление 1 x ТВЕ буфера для электрофореза:

- в мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения;

- срок хранения 1х раствора - 10 дней.

3.7. Приготовление раствора бромистого этидия - C21H20N3Br (10 мг/мл):

- растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды;

- срок хранения в посуде темного стекла при температуре от 4°C до 5°C - 12 мес.

3.8. Приготовление осаждающего буфера СТАВ:

- в мерную колбу внести 1 г СТАВ, 0,5 г NaCl, добавить 100 мл деионизированной воды, довести раствором 30%-ной натрия гидроокиси pH раствора до 8,0, довести объем деионизированной водой до 200 мл;

- хранить при 4°C не более 6 месяцев.

3.9. Приготовление 1,2М NaCl:

- растворить 7,0 г NaCl в 100 мл деионизированной воды, перемешать;

- хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

3.10. Приготовление 10%-ного раствора SDS:

- растворить 10 г SDS в 90 мл дистиллированной воды;

- хранить при комнатной температуре не более 1 года.

4.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ:

- навеску исследуемого гомогенизированного продукта массой 100 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл;

- добавить 300 мкл деионизированной воды, перемешать шпателем;

- добавить 500 мкл лизирующего СТАВ-буфера с меркаптоэтанолом, тщательно перемешать шпателем;

- инкубировать при 65°C 90 минут;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- перенести 500 мкл супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

- добавить 500 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- перенести 500 мкл верхней фракции в чистую пробирку, добавить 500 мкл хлороформа, перемешать;

- центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;

- перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа;

- добавить 2 объема СТАВ-осаждающего буфера, перемешать пипетированием;

- инкубировать 60 минут при комнатной температуре;

- центрифугировать 5 минут при 13000 об./мин.;

- удалить супернатант;

- растворить осадок в 350 мкл NaCl (1,2М);

- добавить 350 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;

- добавить 0,6 объема изопропилового спирта, перемешать;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- удалить супернатант;

- добавить 500 мкл 70%-го раствора этилового спирта и перемешать на вортекс;

- центрифугировать 10 минут при 13000 об./мин.;

- удалить супернатант;

- подсушить осадок не более 5 минут при 65°C для удаления капель спирта;

- растворить осадок в 100 мкл деионизированной воды, осторожно встряхивая, полученный раствор ДНК готов для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР);

- хранить при минус 20°C.

4.2. Сорбционный метод выделения ДНК:

- в центрифужные пробирки типа Эппендорф на 1,5 мл внести 300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала, добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-соль ЭДТА и термостатировать 30 - 60 минут при 65°C;

- к содержимому пробирки добавить 400 мкл лизирующего реагента, перемешать на вортекс до максимально однородного состояния, термостатировать при 65°C 60 - 120 минут;

- перемешать на вортекс, добавить 500 мкл бидистиллированной воды, перемешать на вортекс;

- центрифугировать 1 минуту при 12000 об./мин., прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку;

- добавить 20 мкл сорбента, пробирку поместить на ротатор или перемешивать на вортекс 10 минут при 10 - 20 об./мин.;

- центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;

- удалить супернатант, к осадку добавить 200 мкл лизирующего реагента, перемешать на вортекс до однородного состояния, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;

- удалить супернатант, к осадку добавить 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 - 10 раз, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин.;

- удалить супернатант, не задевая осадка;

- к осадку добавить 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортекс, центрифугировать 10 секунд при 12000 об./мин., удалить супернатант;

- повторить предыдущий пункт еще раз;

- подсушить осадок при 65°C в течение 4 - 5 минут:

- к осадку добавить 50 мкл экстракционного раствора, отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы;

- суспендировать содержимое пробирки на вортекс 5 - 10 секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65°C;

- повторно суспендировать пробу на вортекс, центрифугировать 1 минуту при 12000 об./мин.;

- раствор ДНК перенести в чистую пробирку, хранить при минус 20°C.

5.1. Идентификация видоспецифичной растительной ДНК.

5.2. Скриниговый анализ.

5.3. Идентификация линий ГМО.

6.1. Приготовление 2%-ного агарозного геля:

- к 1 г агарозы добавить 50 мл 1х буфера ТВЕ, тщательно перемешать;

- полученный раствор поместить в микроволновую печь на 2 - 5 мин или прокипятить на водяной бане 15 мин до полного расплавления агарозы;

- расплавленную агарозу охладить до 56°C, добавить 5 мкл бромистого этидия, тщательно перемешать, разлить в подготовленную форму, толщина геля 0,5 - 0,7 см, через 30 - 40 минут удалить гребенку;

- готовый гель использовать сразу или хранить в 1х ТВЕ буфере в холодильнике при +4°C.

6.2. Проведение электрофореза:

- 10 мкл реакционной смеси после аплификации внести в лунку геля, в одну из лунок внести маркер молекулярной массы:

- поместить заполненный гель в камеру для электрофореза с буфером 1х ТБЕ, толщина слоя буфера над поверхностью геля ~ 2 - 3 мм;

- провести электрофорез в режиме постоянного напряжения 100V 70 - 90 минут;

- гель (без формы) поместить на экран трансиллюминатора;

- документировать результат фореза при помощи гель-документирующей системы, фотокопию геля приложить к отчету по идентификации.

7.1. Используются следующие праймеры:

- на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:

5' CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA (39 н.о.),

5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40 н.о.);

- на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

5' ACC GTA CCT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA (33 н.о.),

5' TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA (30 н.о.);

- на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG ACA GA (32 н.о.),

5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);

- на маркерный ген nptII из транспазона Tn5 бактериального происхождения:

5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG C (25 н.о.),

5' ACC CAG CCG GCC ACA GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.):

- на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA (32 н.о.),

5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).

7.2. Набор реактивов для асимметричной мультиплексной ПЦР (амПЦР) включает:

- сухие смеси, включающие Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед. 200 мкМ и 2,5 млМ, оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР:

- растворитель;

- минеральное масло;

- "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 мл.

7.3. Проведение реакции:

- необходимое количество микропробирок с сухими реактивами промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые пробы", "+" контроль";

- добавить во все пробирки по 5 мкл праймеров, 10 мкл растворителя;

- в пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 мкл деионизированной воды, в опытные пробирки - по 5 мкл раствора исследуемой ДНК, в пробирку с положительным контролем - 5 мкл раствора контрольной ДНК;

- добавить во все пробирки по 20 мкл минерального масла;

- пробы готовы для проведения амплификации;

- запустить программу амплификации:

- после проведения амплификации пробы готовы для осуществления гибридизации.

7.4. Гибридизация ДНК, ферментный анализ на биологическом микрочипе и сканирование результатов:

- набор реактивов для ДНК гибридизации и ферментного анализа содержит 20 x SSC - 50 мл, диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток, конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 мл с концентрацией 1 мг/мл, 1 пробирка;

- приготовить рабочие разведения раствора 20 x SSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, pH 7,4): 2 x SSC, 0,1% SDS; 0,1 x SSC; 0,1 x SSC, 0,1% SDS; 0,01 x SSC;

- схема приготовления 100 мл раствора:

- микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1 - 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки, добавить в каждую микропробирку 5 мкл 20 x SSC и 0,2 мкл 10% SDS, перемешать, центрифугировать 1 - 2 секунды при 3000 об/мин, распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов;

- поместить микрочип во влажную камеру, поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42°C;

- по окончании реакции капли смыть буфером 2 x SSC, 0,1% SDS, тщательно промыть чип растворами 2 x SSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 минут, 0,1 x SSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут, 0,1 x SSC - 5 раз по 1 минуте, 0,01 x SSC - в течение 10 секунд.

7.5. Проведение ферментного анализа:

- исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1 x SSC, содержащим 1% БСА (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 мкл на микрочип;

- нанести 25 - 30 мкл разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной температуре;

- смыть конъюгат раствором 1 x SSC;

- залить микрочип раствором 2 x SSC, промыть 5 минут;

- промыть микрочип раствором 1 x SSC;

- непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата - диаминобензидина (ДАБ), для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см3 буфера 0,1 x SSC, добавить 30 мм3 3%-ного раствора пероксида водорода и перемешать, раствор использовать немедленно;

- залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата, выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре;

- в случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата;

- промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42°C на 5 - 10 минут, после сушки микрочип с окрашенными зонами хранить в темном месте.

7.6. Сканирование биологических микрочипов:

- осуществлять с применением аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" и компьютерной программы для анализа изображений;

- в соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом, подготовить сканер микрочипов к работе;

- поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку;

- запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора;

- после завершения сканирования микрочипа сохранить изображение, присвоив файлу соответствующее имя.

7.7. Анализ изображений биочипов:

- запустить программу обработки изображения микрочипа, ввести оцифрованное изображение в программу, для этого выбрать опцию "Файл", открыть изображение, в появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, изображение появится в основном окне программы;

- провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию "Анализ", "Разметка матрицы";

- разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов, для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки, затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла;

- в результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы, чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять";

- после завершения базовой разметки провести автоматическую коррекцию положения зондов, для этого в меню выбрать опцию "Настройки/Автоматическая подстройка";

- для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" - "Показать результаты", по окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний, для этого нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем "Заполнить протокол", после этого появится окно с формой для заполнения, после того как она будет заполнена, нажать кнопку "Выход".

7.8. Интерпретация результатов:

- появление регистрируемого компьютерной программой оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце;

- отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на отсутствие рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец не имеет ГМО растительного происхождения;

- появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноположительного результата, причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования, в этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1H соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ;

- отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного результата, причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе, в этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.

8.1. Метод количественного определения генетически модифицированной сои:

- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий сои в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;

- анализ проводится по гену лектина, который присутствует в геноме всех линий сои, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий сои;

- праймеры на ген лектина:

1) 5' TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3';

2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3';

3) 5'-FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3';

длина ампликона 81 пара нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCC TCT GCC GAC AGT GGT 3';

5) 5' AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C 3';

6) 5'-FAM-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-TAMRA-3';

длина ампликона 82 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной сои;

- условия амплификации:

- результаты исследования, приложение 2.22.

8.2. Метод количественного определения генетически модифицированной кукурузы:

- метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий кукурузы, в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;

- анализ проводится по гену инвертазы кукурузы, который присутствует в геноме всех линий кукурузы, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий, за исключением GA 21;

- праймеры на ген инвертазы кукурузы:

1) 5' CAC TCC ATC GTG GAG AGC TT 3';

2) 5' GGC GTT GTT GAA GAG GAA GA 3';

3) 5'-FAM-TAC CCC ACA CGA GCC ATC TAC GAC T-TAMRA-3';

длина ампликона 111 пар нуклеотидов;

- праймеры, на целевую последовательность ГМО:

4) 5' CGT CTT CAA AGC AAG TGG ATT G 3';

5) 5' TCT TGC GAA GGA TAG TGG GAT T 3';

6) 5'-FAM-TCT CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG CA-TAMRA-3';

длина ампликона 79 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы;

- условия амплификации:

- результат исследований, приложение 2.23.

8.3. Метрологические характеристики метода:

- границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью Р = 0,95, составляют от 0,1% до 5%, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием сертифицированных стандартных образцов состава и свойств, стандартные отклонения повторяемости результатов (дельта) составляют от 0,067 (для стандарта 0,1%) до 0,540 (для стандарта 5%), что соответствует погрешности сертифицированных стандартных образцов состава ГМО растительного происхождения:

- результаты анализа образцов принимают, если коэффициент корреляции калибровочной прямой, построенной по сертифицированным стандартным образцам состава ГМО растительного происхождения, по методу наименьших квадратов (R(2)) > 0,97.

8.4. Метод количественного определения сои линии 40-3-2:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена лектина и генетической конструкции, характерной для сои линии 40-3-2;

- используются зонды, специфичные к трансгену и гену лектина, меченные красителями FAM и VIC соответственно;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои: 5,0%, 2,0%, 1,0%, 0,5% и 0,00%;

- праймеры на ген лектина сои:

1) 5' TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3';

2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3';

3) 5'-VIC-AAC GGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3';

- на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3';

5) 5' GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3';

6) 5'-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-TAMRA-3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР:

- условия амплификации:

8.5. Метод количественного определения сои линии A2704-12:

- основан на ПЦР в реальном времени, с определением гена лектина и области ДНК, специфичной трансформационному событию А2704-12;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои А2704-12: 0,1%, 0,4%, 0,9%, 2,0%; 3,3%;

- праймеры на ген лектина сои:

1) 5' CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA 3';

2) 5' TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC 3';

3) 5' FAM-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-TAMRA-3';

длина ампликона 105 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT 3';

5) 5' ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT 3';

6) 5'-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-TAMRA-3';

длина ампликона 64 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.6. Метод количественного определения кукурузы линии MON 810:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез группы белков, присущих для всех линий кукурузы (hmg) и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 810, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты:

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы - < 0,02%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%:

- праймеры на ген hmg:

1) 5' TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCC CA 3';

2) 5' GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T 3';

3) 5'-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA-3';

длина ампликона 79 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT 3';

5) 5' GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT 3';

6) 5'-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-TAMRA-3';

длина ампликона 92 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.7. Метод количественного определения кукурузы линии MON 863:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 863, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,01%, 1,0%, 5,0%, 10,0%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3';

длина ампликона 84 пары нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3';

5) 5' TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3';

6) 5'-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-TAMRA-3';

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.8. Метод количественного определения кукурузы линии NK 603:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию NK 603, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%, 0,98%, 1,96%, 4,91%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3;

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3';

5) 5' AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T 3';

6) 5'-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TC-TAMRA-3';

длина ампликона 108 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.9. Метод количественного определения кукурузы линии Bt 11:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию Bt 11, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,3%, 0,7%, 1,0%, 1,3%, 2,0%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3';

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';

3) 5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA 3';

5) 5' TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG 3';

6) 5'-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-TAMRA-3';

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.10. Метод количественного определения кукурузы линии T 25:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию T 25, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,15%, 0,40%, 0,90%, 2,00%, 3,30%:

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT 3';

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';

3) 5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';

длина ампликона 136 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC 3';

5) 5' GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG 3';

6) 5'-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-TAMRA-3';

длина ампликона 102 пары нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.11. Метод количественного определения кукурузы линии GA 21:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию GA 21, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1%, 0,49%, 0,98%, 1,3%, 1,71%, 4,26%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3';

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3';

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-TAMRA-3';

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA 3';

5) 5' TGG CTC GCG ATC CTC CT 3';

6) 5'-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA GGT GGG T-TAMRA-3';

длина ампликона 112 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.12. Метод количественного определения кукурузы линии MIR 604:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию MIR 604, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM и VIC;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава и свойств генетически модифицированной кукурузы: менее 0,09%, 0,1%, 0,98%, 9,85%;

- праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3';

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3';

3) 5'-VIC-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';

длина ампликона 136 пар нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCG CAC GCA ATT CAA CAG 3';

5) 5' GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT 3';

6) 5'-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-TAMRA-3';

длина ампликона 76 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.13. Метод количественного определения риса линии LL 62:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез фосфолипазы Д (PLD), присущей для всех линий риса и области ДНК, специфичной трансформационному событию LL 62, на границе генома риса и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAМ;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированного риса: менее 0,09%, 0,45%, 0,9%, 1,8%, 3,6%;

- праймеры на ген PLD;

1) 5' TGG TGA GCG TTT TGC AGT CT 3';

2) 5' CTG ATC CAC TAG CAG GAG GTC C 3';

3) 5'-FAM-TGT TGT GCT GCC AAT GTG GCC TG-TAMRA-3';

длина ампликона 64 пары нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3';

5) 5' TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3';

6) 5'-FAM-CGC ACC GAT TAT TTA TAC TTT TAG TCC ACC-TAMRA-3';

длина ампликона 88 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК риса:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

8.14. Метод количественного определения сахарной свеклы линии H7-1:

- основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез глютамин синтетазы (GS), присущей для всех линий сахарной свеклы и области ДНК, специфичной трансформационному событию H7-1, на границе генома сахарной свеклы и элемента генетической конструкции;

- используются зонды, меченные красителем FAM;

- для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сахарной свеклы: менее 0,1%, 0,5%, 0,9%, 2,0%, 5,0%;

- праймеры на ген GS:

1) 5' GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG 3';

2) 5' GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA 3';

3) 5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3';

длина ампликона 121 пара нуклеотидов;

- праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3';

5) 5' AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3';

6) 5'-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT-TAMRA-3';

длина ампликона 110 пар нуклеотидов;

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сахарной свеклы:

- реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

- условия амплификации:

9.1. Метод количественного определения генно-инженерно-модифицированной сои и кукурузы с использованием наборов "TaqMan GMO Soy Detection Kit" и "TaqMan GMO Maize Detection Kit":

- наборы реактивов предназначены для количественного определения в пищевых продуктах генно-инженерно-модифицированной кукурузы или сои;

- метод основан на ПЦР в реальном времени;

- амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех линий кукурузы или сои, и участок рекомбинантной ДНК в ходе двух независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых флуоресцентным красителем;

- регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием программного обеспечения приборов;

- относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается с использованием стандартных образцов состава путем сравнения результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC, специфичного для всех линий сои или кукурузы;

- выделение ДНК из стандартных образцов состава и из исследуемых образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или набора реактивов "ДНК-сорб-С".

9.2. Метод идентификации и количественного определения ГМО с использованием наборов "Ампликвант ГМ соя", "Ампликвант ГМ кукуруза", "АмплиСенс ГМ соя FTR", "АмплиСенс ГМ кукуруза FTR", разработанных ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.

9.3. Методы количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии GA 21, кукурузы линии NK 603, кукурузы линии MON 863, разработанные Центром "Биоинженерия" РАН.

9.4. Количественное определение сои линии 40-3-2, кукурузы линий GA 21, MON 810, T-25, Bt-176, Bt-11 с использованием наборов реагентов GeneScan Analytics GmbH.

9.5. Методы количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии MON 810, разработанные ГУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН:

9.6. Для определения ГМО растительного происхождения допустимо использование тест-систем с техническими характеристиками, аналогичными указанным выше и разрешенными для использования в установленном порядке.