Купить систему ГАРАНТ Получить демо-доступ Узнать стоимость Информационный банк Подобрать комплект Семинары
  • ДОКУМЕНТ

Приложение 1. Методические указания МУ 2.3.2.2306-07 "Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения"

Приложение 1

 

2.3.2. Пищевые продукты и пищевые добавки

 

Методические указания МУ 2.3.2.2306-07
"Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения"
(утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 30 ноября 2007 г. N 80)

 

I. Общие положения и область применения

 

1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО).

1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях, применяются на этапе государственной регистрации ГМО, впервые поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единой, научно-обоснованной системы оценки безопасности ГМО, и учитывают новые методические подходы, как разработанные в России, так и рекомендованные международными организациями (ВОЗ, ФАО и др.).

 

II. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих заявленные генно-инженерно-модифицированные организмы

 

2.1. Общая характеристика ГМО включает анализ информации, представленной заявителем:

- информации, позволяющей идентифицировать ГМО (вид, сорт, трансформационное событие);

- информации об исходном родительском организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах);

- информации об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, история использования);

- информации о методе генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки);

- информации о ГМО (описание свойств, приобретенных растением в результате модификации, описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения и др.), характеристику различий с родительским организмом (способ размножения, способность к перекрестному опылению, устойчивость к стрессовым воздействиям и др.), характеристику генетической и фенотипической стабильности (должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО), характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы).

2.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании сведений, представленных заявителем, о результатах сравнения химического состава ГМО с химическим составом его традиционного аналога по следующим параметрам:

- содержание белка;

- аминокислотный состав;

- содержание жира;

- жирнокислотный состав;

- углеводный состав;

- содержание витаминов;

- содержание макро- и микроэлементов;

- содержание биологически активных веществ;

- содержание аллергенов;

- содержание антропогенных и природных контаминантов (токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей и др.);

- содержание антинутриентов и других веществ, характерных для растительных организмов данного вида.

Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого растительного организма.

2.3. Оценка композиционной эквивалентности ГМО и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для растений данного вида.

2.4. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки безопасности одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (молекулярная и биохимическая характеристика белка; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank и др.); изучение стабильности белка при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и pH, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белка к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белка в эксперименте на грызунах и др.);

- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные 90-дневных исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.), - в случае если такие исследования проводились;

- результаты других токсикологических исследований.

2.5. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты оценки аллергенных свойств одного или нескольких белков, определяющих проявление заданных признаков у ГМО (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белка в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в т.ч. in vivo);

- результаты аллергологических исследований нативного продукта (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его традиционного аналога и др.), должны быть проведены в случае, если имеются данные об аллергенных свойствах организма-донора.

2.6. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие исследования были выполнены) проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- результаты определения пищевой ценности (так как заданные и незаданные эффекты генетической модификации могут являться причиной изменения баланса макро- и микронутриентов и, следовательно, вести к изменению пищевой ценности продукта);

- результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.

2.7. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга в стране-заявителе и других странах, осуществляемого с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии регистрационных исследований, проводится на основании сведений, представленных заявителем.

 

III. Методы обнаружения, идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов в пищевых продуктах

 

3.1. Экспертная оценка методов идентификации ГМО направлена на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО.

3.2. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО в пищевых продуктах проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- метод идентификации одного или нескольких трансформационных событий;

- метод количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;

- протоколы проведения анализов;

- описание праймеров;

- стандартные образцы состава и свойств.

 

IV. Медико-генетическая оценка генно-инженерно-модифицированных организмов

 

4.1. Медико-генетическая оценка ГМО включает проверку присутствия одной или нескольких синтетических генетических конструкций методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

4.2. Медико-генетические исследования проводятся на основании сведений, представленных заявителем, включающих:

- описание молекулярной структуры одной или нескольких синтетических генетических конструкций (нуклеотидная последовательность);

- метод идентификации и количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;

- протокол проведения анализа;

- описание праймеров;

- стандартные образцы состава и свойств.

 

V. Оценка функционально-технологических свойств генно-инженерно-модифицированных организмов

 

5.1. Перечень и объем исследований по разделу V определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов.

5.2. Изучаемые функциональные свойства:

- pH водной суспензии;

- растворимость;

- реологические свойства водных дисперсий;

- водоудерживающая и жироудерживающая способность;

- критическая концентрация гелеобразования;

- эмульсионная стабильность и др.

 

VI. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов

 

6.1. Перечень и объем исследований по разделу VI определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов.

6.2. Гигиенические исследования ГМО включают определение показателей качества и безопасности:

6.2.1. Перечень показателей безопасности определяется на основании требований СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" для соответствующей группы продуктов.

Изучаемые показатели:

- содержание токсичных элементов;

- содержание микотоксинов;

- содержание пестицидов;

- содержание радионуклидов;

- содержание вредных примесей;

- микробиологические показатели;

- другие показатели (в случае необходимости).

6.2.2. Перечень показателей качества определяется на основании свойств соответствующего растительного организма, а также анализа представленных заявителем материалов. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной эквивалентности ГМО (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для растений данного вида), исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов, пищевых волокон.

6.2.3. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО, должны быть проведены исследования, подтверждающие заявленные изменения.

6.3. Токсикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных:

6.3.1. Схема проведения эксперимента

 

Вид животных

крысы линии Вистар

Пол

самцы

Возраст

40 - 50 дней

Исходная масса тела

70 - 80 г

Количество животных в группе в начале эксперимента

не менее 50 особей в каждой группе

Распределение по группам

Животных делят на 2 группы:

группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО;

группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО

Рацион

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

Карантин

не менее 7-ми дней

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении

Продолжительность эксперимента

180 дней

Забор материала для гематологических, биохимических, морфологических исследований

На 30-й и 180-й дни эксперимента

Количество животных, взятых на исследование

Не менее 10/группу

 

6.3.2. На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности.

Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлен в табл. 1 - 2.

 

Таблица 1

 

Состав базового полусинтетического казеинового рациона

 

Ингредиенты

Кол-во

Белок

Жиры

Углеводы

Калорийность

г

г

г

г

ккал

%

Казеин

25,0

20,20

0,38

-

84,22

22,1

Крахмал маисовый

58,0

0,58

-

50,2

203,12

53,3

Масло подсолнечное нерафинированное

5,0

-

4,99

-

44,91

11,8

Лярд

5,0

-

4,98

-

44,82

11,8

Солевая смесь*

4,0

-

-

-

-

-

Смесь в/р витаминов**

1,0

-

-

1,0

4,00

1,0

Смесь ж/р витаминов***

0,1

-

0,1

-

-

-

Микрокристаллическая целлюлоза

2,0

-

-

-

-

-

Итого

100,1

20,78

10,45

51,2

381,07

100

 

______________________________

* состав солевой смеси представлен в табл. 2.

** 1 г содержит: тиамина (B1) - 0,4 мг, рибофлавина (B2) - 0,6 мг, пиридоксина (B6) - 0,4 мг, никотиновой кислоты - 3,0 мг, пантотената кальция - 1,5 мг, фолиевой кислоты - 0,2 мг, цианкобаламина (B12) - 0,003 мг, викасола - 0,1 мг, L-метионина - 50 мг, глюкозы - до 1 г.

*** 0,1 мл содержит: ретинола ацетата 800 ME, эргокальциферола - 70 ME, альфа-токоферола ацетата - 5 мг, подсолнечного масла - до 0,1 мл.

 

Таблица 2

 

Состав солевой смеси

 

N

Название соли

Химическая формула

Количество, г

1

Хлористый натрий

NaCl

139,3

2

Калий фосфорнокислый

KH2PO4

388,8

3

Магний сернокислый

MgSO4

57,4

4

Кальций углекислый

CaCO3

380,4

5

Железо сернокислое

FeSO4 x 7H2O

26,4

6

Калий йодистый

KI

0,77

7

Марганец сернокислый

MnSO4 x 7H2O

4,55

8

Цинк сернокислый

ZnSO4 x 7H2O

0,53

9

Медь сернокислая

CuSO4 x 5H2O

0,48

10

Кобальт хлористый

CoCl2 x 6H2O

0,024

11

Натрий фтористый

NaF

0,50

12

Алюмокалиевые квасцы

K2SO4Al2(SO4)3 x 24H2O

0,11

 

Итого

 

1000

 

6.3.3. Исследуемые показатели:

6.3.3.1. Интегральные показатели

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

Общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова)

каждые 2 дня

Поедаемость корма

ежедневно

Масса тела

каждые 7 дней

Масса внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, надпочечники, семенники)

На 30-й и 180-й дни эксперимента

 

6.3.3.2. Гематологические показатели

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

- концентрация гемоглобина;

- гематокрит;

- общее количество эритроцитов;

- средний объем эритроцита (СОЭ);

- среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССЭ);

- средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ);

- общее количество тромбоцитов;

- общее количество лейкоцитов;

- дифференцированный подсчет лейкоцитов (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы)

На 30-й и 180-й дни эксперимента

 

6.3.3.3. Биохимические показатели

6.3.3.3.1. Общий биохимический анализ крови

Материал для исследований: сыворотка крови

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

- аланинаминотрансфераза (АЛТ);

- аспартатаминотрансфераза (ACT);

- желчные кислоты;

- фосфатаза щелочная;

- билирубин общий;

- билирубин прямой;

- белок общий;

- альбумин;

- глобулин;

- креатинин;

- глюкоза;

- альфа-амилаза;

- липаза;

- лактатдегидрогеназа;

- общие липиды;

- триглицериды;

- холестерин;

- холинэстераза;

- мочевина;

- хлориды;

- натрий;

- фосфор;

- калий

На 30-й и 180-й дни эксперимента

 

6.3.3.3.2. Общий анализ мочи.

Материал для исследований: моча

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

- суточный диурез;

- цвет и прозрачность;

- относительная плотность;

- pH;

- белок;

- глюкоза;

- креатинин

На 30-й и 180-й дни эксперимента

 

6.3.3.3.3. Системные биомаркеры

6.3.3.3.3.1. Система антиоксидантной защиты

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

Активность ферментов антиоксидантной защиты. Материал для исследований: эритроциты

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- глутатионредуктаза;

- глутатионпероксидаза;

- супероксиддисмутаза;

- каталаза;

Содержание продуктов перекисного окисления липидов. Материал для исследований: кровь, печень

- малоновый диальдегид.

 

6.3.3.3.3.2. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков.

Материал для исследований: печень.

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

Активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- общее содержание цитохрома Р-450;

 

- 7-этоксирезоруфин-О-деэтилаза;

 

- 7-пентоксирезоруфнн-О-деэтилаза;

 

- UDP-глюкуронозилтрансфераза;

 

- глутатионтрансфераза.

 

 

6.3.3.3.3.3. Система регуляции апоптоза.

1) стабильность мембран лизосом.

Материал для исследований: печень.

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

Общая и неседиментируемая активность ферментов лизосом

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- бета-галактозидаза;

 

- бета-глюкуронидаза;

 

- арилсульфатазы A и B.

 

 

2) другие методы.

6.3.3.4. Морфологические исследования

 

Исследуемые органы

Методы исследований

- кожа;

- головной мозг;

- сердце;

- аорта;

- селезенка;

- легкие;

- лимфатические узлы;

- тимус;

- щитовидная железа;

- гипофиз;

- ЖКТ: желудок, тонкая и толстая кишки;

- печень;

- поджелудочная железа;

- почки;

- семенники

На 30-й и 180-й дни эксперимента (плановый забор)

1. Макроскопические исследования

2. Микроскопические исследования:

а) обзорные гистологические исследования

3. Морфометрический анализ

Вскрытие погибших в течение эксперимента животных (внеплановый забор)

1. Макроскопические исследования

2. Микроскопические исследования (перечень исследуемых органов может быть сокращен до минимально необходимого для установления причины смерти):

а) обзорные гистологические исследования.

Дополнительные исследования

1. Микроскопические исследования:

а) гистохимические исследования;

б) иммуногистохимические исследования клеточных популяций и их производных.

2. Электронно-микроскопические исследования.

 

6.4. Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на мышах линий СВА и С57В1/6 и включают изучение его иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:

1) действие на гуморальное звено иммунитета - в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;

2) действие на клеточное звено иммунитета - в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;

3) действие как сенсибилизирующего агента - в тесте чувствительности к гистамину;

4) действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).

В табл. 3 представлены сравнительные характеристики мышей линий СВА и С57В1/6.

 

Таблица 3

 

Характеристики мышей линий СВА и С57В1/6

 

Действующий фактор

Линия мышей

СВА

С57В1/6

Эритроциты барана

высокочувствительны

низкочувствительны

Гиотамин

не чувствительны

чувствительны

Salmonella typhimurium

не чувствительны

чувствительны

 

6.4.1. Схема проведения эксперимента

 

Вид животных

мыши линий СВА и С57В1/6

Пол

самцы

Возраст

половозрелые

Исходная масса тела

18 - 20 г

Распределение по группам

Животных каждой линии делят на 2 группы:

группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО;

группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО

Рацион*

 

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

Карантин

не менее 7-ми дней

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении

 

______________________________

* состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.

 

Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на экспериментальные рационы. В течение эксперимента ведутся наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных.

6.4.2. Исследуемые показатели:

1) действие ГМО на гуморальное звено иммунитета.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 20 животных) и опытной (не менее 20 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн. клеток/мл). Забор крови для исследований проводится на 7-й, 14-й и 21-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют в реакции гемагглютинации общепринятым методом. Полученные данные обрабатывают методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты приводятся в виде M +- m, где M - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка.

2) действие ГМО на клеточное звено иммунитета.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (2 млн. клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозу эритроцитов барана - 0,02 мл (1 млрд. клеток/мышь); в контрлатеральную лапу - 0,02 мл 0,95%-ного раствора хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20 часов путем определения массы опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР).

3) действие ГМО как сенсибилизирующего агента к гистамину.

Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по проценту гибели мышей.

4) действие ГМО на естественную резистентность мышей к S. typhimurium изучают на модели внутрибрюшинного заражения мышей десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм 415. Через 21 день эксперимента мышей контрольной (не менее 30 животных) и опытной (не менее 30 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами культуры: 1000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют , а также процент гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ результатов.

6.5. Аллергологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа "опыт") и его традиционный аналог (группа "контроль"). Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка.

6.5.1. Схема проведения эксперимента

 

Вид животных

Крысы линии Вистар

Пол

Самцы

Возраст

Половозрелые

Исходная масса тела

150 - 180 г

Количество животных в группе в начале эксперимента

не менее 25 особей в каждой группе

Распределение по группам

Животных делят на 2 группы:

группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО;

группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО

Рацион (табл. 4)

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных. Рацион не содержит яичного белка

Карантин

не менее 7-ми дней

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении

Продолжительность эксперимента

29 дней

Забор материала для исследований

На 29-й день эксперимента

 

Таблица 4

 

Стандартный рацион вивария

 

Ингредиент

Масса, г на 1 крысу в день

Крупа овсяная

2,5

Зерновая смесь

14,0

Хлеб 2 сорт

4,0

Творог

2,0

Рыбная мука

0,5

Мясо 2 категория

4,0

Морковь

8,0

Зелень

8,0

Рыбий жир

0,1

Дрожжи

0,1

NaCl

0,15

Основные нутриенты

Белок

3,69

Жир

1,28

Углеводы

12,42

Энергия, ккал

76,0

 

6.5.2. Исследуемые показатели:

На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.

Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА проводят согласно. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Мана-Уитни с использованием пакетов программ Excel и SPSS 11.5.

6.6. Генотоксикологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей. Регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет).

ГАРАНТ:

См. MP 4.2.0014-10 "Оценка генотоксических свойств методом ДНК-КОМЕТ IN VITRO", утвержденные Роспотребнадзором 14 октября 2010 г.

6.6.1. Схема проведения эксперимента

 

Вид животных

мыши линии С57В1/6

Пол

самцы

Возраст

половозрелые

Исходная масса тела

18 - 20 г

Количество животных в группе в начале эксперимента

не менее 15 особей в каждой группе

Распределение по группам

Животных делят на 2 группы:

группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО;

группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО

Рацион*

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

Карантин

не менее 7-ми дней

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении

Продолжительность эксперимента

30 дней

Забор материала для исследований

На 30-й день эксперимента

 

______________________________

* состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.

 

6.6.2. Исследуемые показатели:

1) в основе метода выявления мутагенной активности лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытной группах.

2) регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ.

Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении 200х - 400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100 "ДНК-комет". Анализ "ДНК-комет" может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса.

6.7. Исследования репродуктивной токсичности ГМО проводятся в эксперименте на лабораторных животных и включают:

1) изучение влияния на генеративную функцию;

2) изучение эмбриотоксического и тератогенного действий, регистрируемых в пренатальном и постнатальном периодах развития.

6.7.1. Схема проведения эксперимента

 

Вид животных

крысы линии Вистар

Пол

самцы, самки

Возраст

40 - 50 дней

Исходная масса тела

70 - 80 г

Количество животных в группе в начале эксперимента

не менее 50 особей в каждой группе

/\

/

30 о, 20 о

+

Распределение по группам

Животных делят на 2 группы:

группа "контроль" получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО;

группа "опыт" получает рацион с включением исследуемого ГМО

Рацион*

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

Карантин

не менее 7-ми дней

Начало опытного вскармливания

за 45 - 50 дней перед первым спариванием

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении

 

______________________________

* Состав базового рациона приведен в п. 6.3.2.

 

6.7.2. Исследуемые показатели:

6.7.2.1. Интегральные показатели

 

Изучаемые показатели

Периодичность сбора данных

Общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова)

каждые 2 дня

Поедаемость корма

ежедневно

Масса тела

каждые 7 дней

 

6.7.2.2. Показатели, характеризующие генеративную функцию

 

Изучаемые показатели

Сроки сбора данных

Морфологические исследования семенников (определяют индекс сперматогенеза, среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза)

половозрелые особи

Морфологические исследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и более слоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее количество генеративных форм)

 

6.7.2.3. Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства

 

Изучаемые показатели

Сроки сбора данных

1. Забой и вскрытие не менее 7 беременных самок на группу

19 - 20-й день беременности

2. Визуальное исследование матки, плаценты, плодов: выявление живых и мертвых плодов, подсчет количества желтых тел, мест имплантации, количество резорбций по правому и левому рогу матки (с последующим вычислением пред- и постимплантационной эмбриональной смертности)

3. Анализ эмбрионального материала (не менее 5-ти плодов от каждой крысы)

 

6.7.2.4. Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства

 

Изучаемые показатели

Сроки сбора данных

1. Контроль рождения потомства

20 - 22-й дни беременности

2. Учет величины помета в день родов, подсчет количества живых и мертвых крысят, подсчет особей разного пола, установление внешних уродств, измерение массы тела, определение краниокаудального размера

1-й день жизни

3. Учет показателей физиологического развития крысят: срок отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускание семенников, открытие влагалища; выживаемость потомства

1 - 30 дни жизни

4. Измерение массы тела и роста крысят

1, 4, 7, 14, 21 и 25 дни жизни

 

6.7.3. Отчет по результатам исследований репродуктивной токсичности ГМО должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на внутриутробное развитие и процессы репродукции.