Приложение 2. Методы лабораторной вирусологической диагностики энтеровирусных инфекций

Приложение 2

Методы лабораторной вирусологической диагностики энтеровирусных инфекций

Безопасность работы в лаборатории, выполняющей диагностические исследования энтеровирусных инфекций

Выполнение диагностических исследований энтеровирусных инфекций проводится в лабораториях, организациях, структурных подразделениях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на выполнение работ с микроорганизмами III - IV групп патогенности в соответствии с СП 1.2.731-99. "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

Клинические материалы для диагностических исследований энтеровирусных инфекций, могут быть потенциально инфицированы диким полиовирусом при работе с ними соблюдают правила нормативных документов:

- СП 3.1.2260-07 Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом;

- СП 1.3.1325-03. Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом.

Основные рекомендации по работе лабораторий, выполняющих диагностические исследования энтеровирусных инфекций, содержатся в "Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание, ВОЗ, Женева 2005 г.", "Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита. ВОЗ, Женева 2005 г.".

Правила забора и транспортирования материала от больных для проведения лабораторных исследований

Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактического учреждения. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры, стерильными инструментами.

Упаковка, условия хранения и транспортирования материала для проведения лабораторной диагностики энтеровирусной инфекции должны соответствовать требованиям СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности" и СП 1.3.1325-03 "Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом".

Пробы для выделения вируса берут с соблюдением предосторожностей для исключения контаминации одной пробы материалом другой этого же больного или материалом пробы другого обследуемого. Для отбора проб используют стерильную пластиковую посуду.

Образцы фекалий. Используют пробы фекалий массой (объемом) 1-3 г (1-3 мл). Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 грамма (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон. Две пробы фекалий для выделения вируса отбирают в течение 7 дней после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24-48 часов.

Мазки из ротоглотки. Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой.

После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Смывы из носо/ротоглотки. Сбор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием. Перед сбором материала необходимо предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек) 8-10 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.

Спинномозговая жидкость. Забор СМЖ проводится в первые дни болезни при наличии клинических показаний в асептических условиях с использованием одноразовых пункционных игл. Для исследования отбирают 1 мл СМЖ.

Кровь. Первую пробу крови (5 мл) для серологической диагностики берут как можно раньше после начала болезни, вторую - на 3-4-й неделе, в стадии реконвалесценции.

Содержимое везикул. Для взятия материала везикулы участок кожи протирают спиртом. Пузырек прокалывают иглой или вскрывают скальпелем, собирают вытекающую жидкость на ватный тампон, которым также протирают везикулу. Для повышения информативности исследования необходимо собирать одним тампоном материал не менее чем с трех везикул. Тампон помещают в 1 мл транспортной среды.

В случае летального исхода забирают секционный материал - ткани головного, спинного и продолговатого мозга и варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки. При необходимости исследуют другие материалы (ткань сердечной мышцы, печени, легких, и пр.). Ткани берут как можно раньше после смерти в заранее намеченном порядке для избежания их контаминации содержимым желудка и кишечника. Для иссечения тканей используют набор стерильных инструментов для каждой пробы. Объем пробы (кусочка) из тканей центральной нервной системы должен составлять примерно 1 ; из толстой кишки иссекается сегмент длиной 3-5 см, содержащий фекальные массы. Каждую пробу помещают в отдельный стерильный флакон с транспортировочной средой.

Пробы немедленно отправляют в лабораторию. Если отправка проб в лабораторию задерживается, их помещают в холодильник при температуре +4° - +8°С. Если время до отправки превышает 24 часа пробы замораживают и соблюдают эти условия во время транспортировки. Сыворотки без добавления консервантов хранят при 4° или в замороженном виде.

Транспортировку осуществляют в строгом соответствии с СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности".

При транспортировке материалов в лабораторию соблюдают принцип "тройной упаковки":

1) первичная емкость - маркированный контейнер/пробирка/флакон с пробой, надежно закрытая крышкой, герметизированной лабораторной пленкой или парафином;

2) вторичная емкость - прочный водонепроницаемый, непротекающий контейнер (или полиэтиленовый пакет) с поглощающим материалом в достаточном количестве для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Во вторичную емкость помещают контейнер/пробирку/флакон с пробой. Образцы от одного пациента упаковываются отдельно. Также во вторичную емкость помещают направление на исследование, вложенное в полиэтиленовый пакет, где указано ФИО, возраст и адрес проживания больного, дата начала заболевания, дата отбора материала, предварительный клинический диагноз, дата последней иммунизации против полиомиелита.

3) внешняя упаковка - прочный термоизолирующий контейнер или термос. Для обеспечения температурных условий, в термоконтейнеры помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. На внешней поверхности термоконтейнера укрепляют этикетку с указанием адреса, телефона, факса, электронной почты отправителя, адреса, телефона, факса, электронной почты получателя, условий транспортировки и знак биологической опасности.

Перед отправкой материалов отправитель должен проинформировать получателя о планируемой отправке и ее сроках. Недопустимо отправлять материалы без предварительной договоренности с получателем.

Выделение энтеровирусов и выявление геномных последовательностей энтеровирусов

Культуры клеток

Универсальной культуры клеток (или культуральной системы), пригодной для выделения всех энтеровирусов, не существует. Ряд штаммов энтеровирусов могут быть выделены только in vivo с использованием чувствительных лабораторных животных. Обобщенные сведения о чувствительности наиболее распространенных в лабораториях перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам представлены в таблице 1.

Таблица 1. Чувствительность перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам

Вирусы	Проявление цитопатогенного эффекта на культуре клеток
	RD	Hep-2	L20B	BGM
Полиомиелита 1-3	+	+	+	+
ЕСНО	+	-	-	+-
Коксаки А	+- за исключением не размножающихся А1, А19, А22	-	(Коксаки А 2-6, 8, 10, 14)	-
Коксаки В	-	+	-	+
Энтеровирусы 68-71	+/-	-	-	-

Для увеличения вероятности выделения энтеровируса из исследуемого материала целесообразно использовать не менее двух видов культур клеток, одной из которых должна быть культура клеток RD.

Эффективность исследования материала зависит от состояния клеточных культур: клетки должны сохранять высокую чувствительность к энтеровирусам, аутентичность, стабильность, должны быть свободны от загрязнения микроорганизмами (простейшими, бактериями, грибами, дрожжами, микоплазмами, вирусами).

Культуры клеток должны быть получены из аттестованного официального источника. Подробные рекомендации по работе с культурами клеток изложены в "Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание. ВОЗ. Женева 2005 г.".

Подготовка проб для исследования в культуре клеток

Пробы фекалий. Готовят 10-20% суспензию фекалий в сбалансированном солевом растворе (ФСБ) с антибиотиками. Пробы обрабатывают хлороформом для удаления бактериального и грибкового загрязнения, токсичных липидов, диссоциации вирусных агрегатов.

В маркированную центрифужную пробирку последовательно добавляют 10 мл ФСБ, 5 г стеклянных бус и 0,5 мл хлороформа. Вносят примерно 2 г фекальной пробы, плотно закрывают пробирку и интенсивно встряхивают в течение 20 минут. Центрифугируют с охлаждением в течение 20 минут при 1500 g. Надосадочную жидкость отбирают для исследования.

Тампоны. Тампоны встряхивают в транспортировочной среде для высвобождения клеточного материала, избегая образования аэрозолей. Полученную суспензию обрабатывают хлороформом, как описано выше.

Спинномозговая жидкость. Пробы спинномозговой жидкости используют для исследования без дополнительной обработки. Если проба мутная, ее осветляют центрифугированием при 1600-2000 g в течение 10 минут.

Тканевые пробы. Готовят 10-20% тканевую суспензию. Ткани растирают в стерильной ступке, добавляя при необходимости стерильный песок и небольшое количество транспортировочной среды. Суспензию осветляют центрифугированием при 1600-2000 g в течение 10 минут.

Выделение и идентификация вирусов на культуре клеток

Энтеровирусы идентифицируют в реакции нейтрализации инфекционности с помощью диагностических типоспецифических иммунных сывороток. В опыте по нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 , смешивают в равном объеме с диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1-2 часов при 37°С, смесь вводят в культуры клеток. Иммунная сыворотка, которая предотвращает развитие ЦПЭ, указывает на тип вируса.

Детекция РНК энтеровирусов с помощью ПЦР

Применение ПЦР тест-систем рекомендовано при:

- необходимости проведения исследований большого количества образцов при развитии вспышек энтеровирусной инфекции.

- решении рутинных задач клинической диагностики.

- при осуществлении эпидемиологического надзора за энтеровирусами как элемента скрининга в сочетании с методиками молекулярного генотипирования энтеровирусов и/или вирусологическими исследованиями.

- в случае применения генотипоспецифических тест-систем - осуществление оперативного надзора за определенными серотипами энтеровирусов, ассоциированными со вспышками заболеваний (EV71 - HFMD)

- ПЦР позволяет выявлять энтеровирусы, не вызывающие ЦПЭ на культуре клеток.

Проведение молекулярно-диагностических работ осуществляется в соответствии с МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности".

Для детекции РНК используют ПЦР-тест-системы, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Проведение и интерпретация результатов реакции выполняется в соответствии с инструкцией производителя.

В том случае, если используемая тест-система не позволяют идентифицировать энтеровирусы до уровня серотипа, могут быть пропущены присутствующие в пробе полиовирусы. Поэтому при обнаружении РНК энтеровируса методом обратной транскрипции и ПЦР необходимо провести выделение вируса на культуре клеток и его идентификацию или его идентификацию молекулярными методами.

Молекулярное типирование энтеровирусов основано на ОТ-ПЦР и определении нуклеотидной последовательности в области генома, кодирующей белок капсида VP1. Проведение субтипирования энтеровирусов методом амплификации и прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей VP1 региона обладает высокими показателями специфичности и может производиться с применением лабораторных методик, не имеющих государственной регистрации на территории РФ. Генотип энтеровируса определяют сравнением полученной последовательности с имеющимися в банке генетических последовательностей (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) последовательностями прототипных энтеровирусов человека.

Серологические методы диагностики энтеровирусных инфекций

Определение антител проводят с диагностической целью или при изучении эпидемиологических аспектов инфекции в реакции нейтрализации инфекционности.

Для диагностических целей исследуют две пробы сыворотки, взятые с интервалом не менее 14 дней. Диагностически значимым считают сероконверсию или 4-кратный и больший подъем титра антител.

Для эпидемиологических исследований достаточно одной пробы сыворотки от каждого обследуемого; для получения репрезентативных результатов важен правильный отбор обследуемых лиц и компоновка групп.

Разведения сыворотки смешивают с равными объемами разведения вируса, содержащего 100 . Смесь выдерживают 2 часа при 37° и вносят в 2-3 лунки с культурой клеток. Контроли должны включать: а) наименьшее разведение сыворотки для проверки токсичности; б) контроль качества клеток со средой; в) титрование рабочей дозы вируса. Титром сыворотки считают наибольшее разведение, защищающее 50% зараженных культур от действия 100 вируса.