Методические указания МУК 4.1.2107-06 "Определение массовой концентрации фенола в биосредах (моча) газохроматографическим методом" (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко от 9 августа 2006 г.)

Фенол	Молекулярная масса 128,56
С6Н5ОН

Фенол - бесцветные кристаллы с характерным запахом, - 181,75°С. Растворим в воде и органических растворителях. Является сильным нейротоксином, поражает печень, почки, проникает через кожу [1].

2. Сущность метода

Методика основана на предварительном переводе фенола в фенилацетат с помощью уксусного ангидрида в щелочной среде, концентрировании продукта дериватизации из биологического материала (моча) экстракцией метиленхлоридом и последующем газохроматографическом анализе экстракта. Необходимость превращения фенола в производные вызвана тем, что прямой газохроматографический анализ фенолов, особенно следовых количеств, осложнен высокой полярностью фенольных соединений и низким давлением их паров. Улучшить газохроматографические свойства фенола можно путем превращения их в менее полярные соединения.

Выполнение измерений массовой концентрации фенола проводят методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора. Определению не мешают о-, м-, п-крезолы, ксиленолы, хлорфенолы в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемых концентраций фенола. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 20 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками

3.1. Средства измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором
Секундомер "Агат"	ТУ 25-1894.003-90
Микрошприцы МШ-10	ТУ 2.833.106-00
Весы аналитические ВЛР-200	ГОСТ 24104-01
Разновесы Г_2-210	ГОСТ 7328-01
Линейка измерительная	ГОСТ 427-75
Лупа измерительная	ГОСТ 25706-83
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100 и 1 000 см3	ГОСТ 1770-74
Пипетки, вместимостью 5, 10 см3	ГОСТ 29227-91

3.2. Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стеклянная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм
Бидистиллятор стеклянный БС	ТУ 25-11.1592-81
Редуктор кислородный	ТУ 26-05-236-73
Центрифуга СМ-4,3 000 об./мин
Бюксы стеклянные	ГОСТ 25336-82
Воронка делительная	ГОСТ 23932-90

3.3. Материалы

Гелий в баллоне	ТУ 51-940-80
Водород технический	ГОСТ 3022-80
Воздух в баллоне	ГОСТ 17433-80

3.4. Реактивы

3% OV-1 на хроматоне N-cупep фракции 0,16-0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки
Фенол, чда	ТУ 6-09-5303-86
Нафталин, хч	ТУ 6-09-2200-77
Натрия карбонат, чда	ГОСТ 83-79
Уксусный ангидрид, ч	МРТУ 6-09-5708-68
Ацетон, осч	ТУ 2633-004-11291058-9
Метиленхлорид, хч	ТУ 6-09-2662-77
Серная кислота, осч	ГОСТ 14262-78
Калия дихромат, чда	ГОСТ 4220-75

3.5. Растворы

Раствор калия дихромата, 3%-й

4. Требования к безопасности

4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.

4.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87).

4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6. Условия измерений

6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха ()°С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С.

6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть бидистиллированной водой и просушить при температуре 120°С.

7.2. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелий) с расходом 30 при температуре 250°С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

7.3. Приготовление аттестованных смесей

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую исследуемого компонента, и готовят серию рабочих аттестованных растворов.

Исходный аттестованный раствор фенола. В мерную колбу объемом 25 , содержащую ацетон в объеме 15 , вводят 10 мг фенола, и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 . Срок хранения - 5 ч.

Исходный аттестованный раствор нафталина. В мерную колбу объемом 25 , содержащую ацетон в объеме 15 , вводят 10 мг нафталина, и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 . Срок хранения - 3 дня.

7.4. Определение градуировочных коэффициентов фенола по отношению к внутреннему стандарту

Рабочий аттестованный раствор. В мерную колбу объемом 50 , содержащую 30 мочи, вносят объемы исходных аттестованных растворов фенола и нафталина согласно табл. 1. Содержимое колбы доводят до метки мочой.

Таблица 1

Рабочие аттестованные растворы для установления градуировочных коэффициентов фенола по отношению к внутреннему стандарту

Номер смеси	1	2	3	4	5	6
Фенол, объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/см3), см3	0,005	0,010	0,02	0,025	0,040	0,05
Концентрация фенола, мкг/см3	0,04	0,08	0,16	0,20	0,32	0,40
Нафталин, объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/см3), см3	0,10	0,09	0,07	0,05	0,03	0,02
Концентрация нафталина, мкг/см3	0,80	0,72	0,56	0,40	0,24	0,16

Для определения градуировочных коэффициентов в делительную воронку объемом 250 вносят 50 рабочего аттестованного раствора и добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 уксусного ангидрида и встряхивают в течение 0,5 мин для перевода фенола в уксуснокислый эфир.

Продукт ацилирования дважды экстрагируют метиленхлоридом порциями по 2,5 в течение 2 мин. Экстракты центрифугируют в течение 10 мин. После удаления белка объединенные органические вытяжки помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 .

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 каждого экстракта рабочего аттестованного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок - 110°С;

температура испарителя - 170°С;

температура детектора - 170°С;

расход газа-носителя (гелий) - 30 ;

скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч;

      время удерживания ацетата фенола - 3 мин 20 с;

                        нафталина - 6 мин.

На полученной хроматограмме определяют высоты или площади пиков определяемого компонента и внутреннего стандарта и по средним результатам из 6 серий рассчитывают градуировочные коэффициенты.

Значение градуировочного коэффициента вычисляют по формуле:

, где

, - площади пиков исследуемого компонента (фенилацетата) и внутреннего стандарта (нафталина), ;

, - количество исследуемого компонента (фенилацетата) и внутреннего стандарта (нафталина), мкг.

По результатам 7 измерений определяется среднее значение градуировочного коэффициента и строится градуировочный график в координатах градуировочный коэффициент - отношение площадей пиков .

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5. Отбор проб

Отбор проб мочи в объеме не менее 200 производят в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

8. Выполнение измерений

Пробу мочи в объеме 50 помещают в делительную воронку объемом 250 , добавляют внутренний стандарт - нафталин 0,1 (исходный аттестованный раствор 400 ) и 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 уксусного ангидрида и встряхивают в течение 0,5 мин для перевода фенола в уксуснокислый эфир. Продукт ацилирования дважды экстрагируют метиленхлоридом порциями по 2,5 в течение 2 мин. Экстракты объединяют и центрифугируют в течение 10 мин. После удаления белка объединенные органические вытяжки помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 . Полученный экстракт хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе методом внутреннего стандарта. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 7.4).

9. Вычисление результатов измерений

На хроматограмме рассчитывают площади пиков фенилацетата и внутреннего стандарта (нафталина).

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных измерений , , расхождение между которыми не должно превышать значения предела повторяемости (табл. 3).

Расчет концентрации фенола () в биопробе вычисляют по формуле:

, где

X- концентрация фенола в биопробе, ;

, - площади пиков фенилацетата и нафталина, ;

- градуировочный коэффициент (устанавливается по градуировочному графику - - );

- навеска нафталина, мкг;

V - объем пробы, .

Результат измерения представляют в виде , где

- средний результат анализа, ,

при условии:

, где

- максимальный результат из 2-х параллельных измерений;

- минимальный результат из 2-х параллельных ихмерений.

- значение предела повторяемости, %;

- характеристика погрешности, при Р = 0,95, равная:

, где

- относительное значение характеристики погрешности,% (табл. 2).

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа". Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, воспроизводимости

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/см3	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратиче- ское отклонение повторяемости), сигма , % r	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратичес- кое отклонение воспроизводимости), сигма , % R_ Xl	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности P = 0,95), +-дельта,%
Фенол, от 0,04 до 0,40 вкл.	6,9	2,9	10,0

Таблица 3

Значения пределов повторяемости и воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 0,95

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/см3	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r , % n	Предел внутрилабораторной воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории, но в разных условиях), R _ ,% Xl
Фенол, от 0,04 до 0,40 вкл.	10,3	8,0

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержания исследуемых соединений в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы, с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать значения предела повторяемости (табл. 3).

Повторяемость результатов параллельных измерений признают удовлетворительной, если

, где

- значение предела повторяемости, %.

- максимальный результат 2-х параллельных измерений;

- минимальный результат из 2-х параллельных измерений.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т. д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

, где

- средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных измерений, ;

- средний результат анализа рабочей пробы, из 2-х параллельных измерений, полученный в других условиях, ;

-значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % (табл. 3).

Расхождение между результатами измерений и , полученными в разных условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 3.

10.4. Контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом контрольного измерения содержания фенола в пробе с известной добавкой () в рабочей пробе без добавки () и величиной добавки (добавка должна составлять не менее 40% от содержания фенола в рабочей пробе) с нормативом точности К.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

, где

- средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, ;

- средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, ;

- величина добавки к пробе, .

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительной при выполнении условия: .

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют.

Периодичность контроля исполнения процедуры ВКК регламентируют в руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов: Справ. изд. /Под ред. В.А. Филова и др. Л.: "Химия", 1990.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас

Получить бесплатный доступ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.