Методические указания МУК 4.1.2116-06 "Определение массовой концентрации стирола в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 9 августа 2006 г.)

C6H5CHCH2

Молекулярная масса: 103,07

Стирол (винилбензол, фенилэтилен) - бесцветная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 145°С, плотность 0,9059. Растворяется в большинстве органических растворителей, растворимость в воде 0,032% по объему (20°С) [1]. Стирол оказывает общетоксическое, сенсибилизирующее, эмбриотропное, раздражающее действия, отрицательно влияет на ЦНС, обладает кумулятивным эффектом [2].

2. Сущность метода

Методика основана на извлечении стирола из крови экстракцией гексаном и анализе экстракта на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации стирола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Нижний предел измерения - 0,001 мкг.

Определению не мешают фенол, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы, карбоновые кислоты.

Длительность анализа, включая пробоподготовку - 20 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления и ультрафиолетовым детектором
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические	ГОСТ 24104-01
Гири Г_2-210	ГОСТ 7328-01
Микрошприцы МШ-10	ТУ 2.833.106-00
Колбы мерные, вместимостью 50 см3	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные, вместимостью 1, 5, 10 см3	ГОСТ 29227-91
Редуктор кислородный	ТУ 26-05-236-73
Аттестованная смесь стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,00 мг/см3	ГСО МСО 0056.1998

3.2. Вспомогательные устройства

Колонка стеклянная длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon SGX С_18 зернением 7 мкм
Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон"	ТУ 9443-001-245.23530-97
Экстрактор ПЭ-8	ТУ 3614-001-23050963-97
Дистиллятор	ТУ 61-1-721-79
Сушильный шкаф ШСС-80	ТУ 16.531.743-83
Воронки делительные, вместимостью 250 см3	ГОСТ 23932-90
Воронка Шотта (пор 16)	ГОСТ 25336-82
Бюксы СВ 19/9	ТУ 92-891.029-91
Пробирки центрифужные пропиленовые с завинчивающейся крышкой, производство "Sarstedt", Германия

3.3. Реактивы

Гексан для хроматографии, осч	ТУ 6-09-4521-77
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, осч	ТУ 6-09-14-2167-84
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Гидроксид натрия, хч	ГОСТ 4328-77
Спирт этиловый	ГОСТ Р 51652-2000
Серная кислота	ГОСТ 4204-77
Калия дихромат, хч	ГОСТ 4220-75
Раствор гепарина в ампулах (5 000 ед. в 1 см3)

3.4. Материалы

Гелий газообразный

ТУ 51-940-80

3.5. Растворы

Элюент для хроматографии

Раствор гидроксида натрия, 10%-й

Раствор дихромата калия в серной кислоте, 3%-й

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химреактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.

4. Требования к безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и меры безопасности, указанные в "Руководстве по правилам эксплуатации прибора".

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и владеющие техникой жидкостно-хроматографического анализа.

6. Условия измерений

6.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха 15-25°С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С.

6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе двухромовокислого калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120°С.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Элюент для хроматографии. Смешивают 60 ацетонитрила с 40 дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3-5 мин со скоростью 50-60 /мин.

7.2.2. Раствор гидроксида натрия 10%-й. Вносят в мерный стакан с меткой на 100 10 г гидроксида натрия, прибавляют 90 дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана до полного растворения гидроксида натрия. Срок хранения раствора - 30 дней при 4°С.

7.2.3. Раствор двухромовокислого калия в серной кислоте 3%-й. Растворяют 3,0 г двухромовокислого калия в 53 см концентрированной серной кислоты (плотность 1,84). Использовать свежеприготовленный раствор.

7.3. Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.2.1, со скоростью 0,6 /мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

7.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации стирола в крови, устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят разбавлением аттестованной смеси стирола в этиловом спирте (растворы А, Б).

7.4.1. Приготовление раствора А: 1 аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/ вносят в мерную колбу вместимостью 100 и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.2. Приготовление раствора Б: 10 аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/ вносят в мерную колбу вместимостью 100 и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

7.4.3. В соответствии с п. 8 проводят анализ образца крови на отсутствие стирола. Объем образца крови для приготовления градуировочных смесей должен быть не менее 12 . Образец крови с гепарином (из расчета 0,05 гепарина на 2 крови) может храниться 2 дня при температуре 4°С.

7.4.4. Для установления градуировочной характеристики в 2 крови добавляют 0,05 раствора гепарина, вносят раствор А или Б в соответствии с табл. 1 и помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 дистиллированной воды, 0,2 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 гексана. Содержимое воронки перемешивают экстрактором со скоростью 2500 об./мин в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют в течение 5 мин при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 мм3 вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме прибора.

Таблица 1

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации стирола в крови

Номер раствора	1	2	3	4	5	6
Объем раствора А, мм3 (С = 0,01 мг/см3)	20,0	40,0	100,0	-	-	-
Объем раствора Б, мм3 (С = 0,10 мг/см3)	-	-	-	20,0	50,0	100,0
Массовая концентрация стирола в крови, мг/дм3	0,1	0,2	0,5	1,0	2,5	5,0

Режим работы хроматографа:

колонка стеклянная длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon SGX C-18;

подвижная фаза - ацетонитрил/вода в соотношении 60 : 40;

скорость подвижной фазы - 0,6 /мин;

длина волны УФ-детектора 254 нм;

время выхода стирола в заданных условиях - 6 мин.

Градуировочную характеристику устанавливают с помощью градуировочного коэффициента, который рассчитывают по формуле:

, где

- заданная концентрация стирола в градуировочной смеси, мг/;

- среднее значение трех измерений площади пика, или единицы оптической плотности (е.о.п);

n - количество градуировочных смесей (n = 6).

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5. Отбор проб

Отбор проб венозной крови в объеме 4 производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,1 раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике не более 2-х суток.

8. Выполнение измерений

Проводят два параллельных измерения образца крови: 2 крови помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 дистиллированной воды, 0,2 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 гексана. Перемешивают содержимое воронки экстрактором со скоростью 2500 об./мин в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют в течение 5 мин при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме хроматографа, указанном в п. 7.4.4.

Идентификация хроматографического пика стирола проводится путем сопоставления времен удерживания хроматографических пиков в стандартном растворе стирола и в анализируемой пробе.

9. Вычисление результатов измерения

Концентрацию стирола в крови (мг/) вычисляют по формуле:

, где

Х - концентрация стирола в анализируемой пробе, мг/;

- площадь пика стирола на хроматограмме, или е.о.п;

К - градуировочный коэффициент.

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений , , расхождение между которыми не должно превышать значения предела повторяемости (табл. 2).

Результат измерения представляют в виде мг/, где

- средний результат анализа, мг/,

- характеристика погрешности, мг/, при Р = 0,95 равная:

, где

- относительное значение характеристики погрешности, %.

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Значения пределов повторяемости и воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 0,95

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, 3 мг/дм	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r , % n	Предел внутрилабораторной воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории, но в разных условиях), R , % - X i
Стирол, от 0,1 до 5,0 вкл.	26,5	27,6

Таблица 3

Диапазон измерений, значения показателен точности, повторяемости, воспроизводимости

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, 3 3 мг/дм (мкг/см )	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратиче- ское отклонение повторяемости), сигма , % r	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратиче- ское отклонение воспроизводимости) сигма , % R	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности P = 0,95) +-дельта, %
Стирол, от 0,1 до 5,0 вкл.	10,0	13,5	23,0

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствует началу, середине и концу диапазона измерений. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы, с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать значения предела повторяемости (табл. 2).

Повторяемость результатов параллельных определений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

, где

- значение предела повторяемости, %;

, - максимальный и минимальный результаты двух параллельных измерений содержания i-го вещества, мг/.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

, где

- средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных измерений, мг/;

- средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных измерений, полученный в других условиях, мг/;

- значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % (табл. 2).

Расхождение между результатами измерений и , полученных в разных условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 2.

10.4. Контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом контрольного измерения содержания определяемого компонента в пробе с известной добавкой (), в рабочей пробе без добавки () и величиной добавки (добавка должна составлять не менее 40% от содержания анализируемого компонента в рабочей пробе) с нормативом точности К. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

, где

- средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, мг/;

- средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мг/;

- величина добавки к пробе, мг/.

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительной при выполнении условия:.

При превышении норматива контроля точности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Периодичность контроля воспроизводимости и точности регламентируется в руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Химическая энциклопедия /Под ред. Н.С. Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1995. Т. 4.

2. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник. М.: "Химия", 1976. Т. 1. с. 113-117.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас

Получить бесплатный доступ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.