ВектоРубелла-IgG-стрип (Диагностикум краснухи)

Торговое название: ВектоРубелла-IgG-стрип (VectoRubella-IgG-strip)

Международное название: Диагностикум краснухи&

Фармакологическая группа: МИБП-диагностикум

Фармакологическая группа по АТХ: V04CX. Другие диагностические средства

Описание:

Тест-система "ВектоРубелла-IgG-стрип" представляет собой набор реагентов для выявления иммуноглобулинов класса G (IgG) к вирусу краснухи в сыворотках крови методом иммуноферментного анализа. Основным реагентом набора является очищенный антиген вируса краснухи, сорбированный на поверхности лунок полистиролового разборного планшета. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизованным антигеном. Имеющиеся в сыворотке специфические антитела к вирусу связываются с иммобилизованным антигеном. Несвязавшийся материал удаляют отмывкой. Связавшиеся антитела выявляют при инкубации с конъюгатом антител к IgG человека с пероксидазой хрена. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность жёлтого окрашивания пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце IgG к вирусу краснухи. Набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контрольные образцы. Для исследования небольших партий проб возможны 12 независимых постановок по 8 анализов каждая, включая контрольные образцы. Набор комплектуется всеми необходимыми для ИФА реагентами. Чувствительность тест-системы -10 МЕ/мл.

СОСТАВ НАБОРА: планшет разборный с иммобилизованным антигеном вируса краснухи - 1 шт.; положительный контрольный образец, инактивированный (К+, жидкость красного цвета), концентрация специфических IgG указана на флаконе - 1 фл., 3 мл; отрицательный контрольный образец, инактивированный (К-, бесцветная или бледно-жёлтая жидкость) - 1 фл., 3 мл; конъюгат (антитела против IgG человека, меченные пероксидазой, жидкость синего цвета) - 1 фл., 1,5 мл; раствор для предварительного разведения сывороток (жидкость малинового цвета) - 1 фл., 10 мл; раствор для разведения сывороток (РРС, бесцветная или бледно-жёлтая жидкость) - 1 фл., 12 мл; раствор для разведения конъюгата (РРК, бесцветная или бледно-жёлтая жидкость) - 1 фл., 12 мл; концентрат тетраметилбензидина (ТМБ, бесцветная или желтоватая жидкость) - 1 проб., 1 мл; концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (25xФСБ-Т, прозрачная бесцветная жидкость, допускается выпадение осадка солей) - 1 фл., 20 мл; цитратно-фосфатный буферный раствор с перекисью водорода (ЦФР, прозрачная бесцветная жидкость) - 1 фл., 12 мл; стоп-реагент (прозрачная бесцветная жидкость) - 1 фл., 12 мл; плёнка липкая - 2 шт.

Показания к применению:

Тест-система предназначена для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу краснухи в сыворотке (плазме) крови человека, определения их концентрации, титра положительных сывороток и может быть использована в клинике для постановки и подтверждения диагноза краснухи, а также для проведения сероэпидемиологических исследований и скрининга сывороток при контроле вакцинопрофилактики.

Методы применения и принцип действия:

СБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ: Забор крови должен производится согласно стандартной процедуре забора крови из вены с соответствующими предосторожностями. Свежие образцы сыворотки (плазмы) могут храниться при 2-10 град. С в течение одной недели при условии отсутствия микробной контаминации. Образцы могут подвергаться замораживанию/оттаиванию только однократно, т.к. повторное замораживание/оттаивание приводит к неправильным результатам. После размораживания образец следует тщательно перемешать. Длительное хранение образцов проводят при -20 град. С или ниже. Образцы, содержащие осадок, перед анализом должны быть очищены центрифугированием в течение 5 мин при 5-10 тыс. об./мин. Не использовать образцы с выраженной гиперлипидемией. Для отбора исследуемых образцов и компонентов тест-системы использовать автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5%.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ. Достоверность результатов зависит от правильного выполнения следующих правил: Не используйте реагенты с истекшим сроком годности. Не заменяйте реагенты данной серии реагентами другой серии. Все компоненты подобраны для оптимального проведения теста. Не проводите ИФА в присутствии паров кислот, щелочей, альдегидов или пыли, которые могут менять ферментативную активность конъюгатов. Используйте стеклянную посуду, тщательно вымытую и ополоснутую дистиллированной водой, или (предпочтительно) одноразовую посуду. Перед использованием необходимо выдержать реагенты 30 минут при комнатной температуре (18-25) град. С. Аккуратно разводите реагенты, избегая любого загрязнения. Не допускайте высыхания стрипов в перерыве между завершением промывки и внесением реагентов. Ферментативная реакция очень чувствительна к присутствию ионов металла. Поэтому не допускайте контактов каких-либо металлических предметов с конъюгатом и растворами субстратов. Используйте для внесения каждой пробы чистый наконечник. Никогда не используйте одну и ту же ёмкость, для приготовления конъюгата и раствора ТМБ. Обращаем Ваше особое внимание на то, что малейшее, даже не видимое глазом загрязнение пипеток раствором конъюгата может привести к контаминации всего содержимого флаконов с ЦФР и ТМБ. Поэтому необходимо протирать рабочую поверхность стола и конус пипетки (внутреннюю и внешнюю поверхности) 70% этиловым спиртом перед внесением ТМБ в ЦФР. Проверяйте пипетки и другое оборудование на точность и правильность работы. Не изменяйте протокол исследования. Если допущена ошибка при внесении анализируемых образцов, нельзя, опорожнив эту лунку, вносить в неё новый образец. Такая лунка бракуется. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены:

1. Получением неправильного рабочего разведения исследуемых сывороток (например, 1:70; 1:50). Для получения правильного рабочего разведения исследуемых сывороток необходимо: а) при отборе 10 мкл сыворотки для предварительного разведения не погружать наконечник глубоко в сыворотку, чтобы исключить налипание сыворотки на внешнюю поверхность наконечника. б) тщательно перемешивать сыворотку при предварительном разведении 1:10.

2. Контаминацией отрицательных сывороток в рабочем и вспомогательных планшетах положительными сыворотками из соседних лунок; вероятность такой контаминации особенно высока при первичном скрининге исследуемых сывороток, так как на весь планшет обычно выявляется всего несколько отрицательных сывороток. Для исключения взаимной контаминации сывороток во вспомогательном планшете для предварительного разведения сывороток и в рабочем планшете необходима тщательная и аккуратная работа, без разбрызгивания растворов. При скрининге исследуемых сывороток рекомендуется для сывороток, дающих ОП меньше 0,5-0,8 о.е., поставить отдельно дополнительный анализ.

1.ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ.

1.1. Подготовка стрипов. Цефленовый пакет вскрыть выше замка на 1 см. Планшет в упаковке должен быть выдержан 30 мин при комнатной температуре (18-25) град. С перед его вскрытием для предотвращения конденсации влаги на стрипах. Для проведения ИФА рассчитать необходимое количество стрипов, оставшиеся стрипы снять с рамки и сразу плотно упаковать в цефленовый пакет с осушителем, удалить из него воздух и плотно закрыть замок. Стрипы стабильны после первого вскрытия цефленового пакета в течение 4 недель при 2-10 град. С.

1.2. Подготовка контрольных образцов. Контрольные образцы готовы к использованию и не требуют дополнительного разведения.

1.3. Подготовка исследуемых сывороток. Исследуемые сыворотки развести в 10 раз раствором для предварительного разведения сывороток. Для этого внести во вспомогательный ряд пробирок или в лунки вспомогательного планшета по 90 мкл раствора и добавить по 10 мкл цельной сыворотки, тщательно перемешать. При этом малиновый цвет должен измениться на жёлтый. Если изменения цвета не произошло, данная сыворотка может дать неправильный результат. Разведённые сыворотки не хранить!

1.4. Приготовление раствора для отмывки планшета. Количество используемого раствора для отмывки планшета, в зависимости от числа стрипов, приведено в таблице 1. При выпадении осадка солей в концентрате ФСБ-Т необходимо прогреть его при 30-40 град. С до полного растворения осадка. Хранение: до 1 недели при 2-10 град. С.

1.5. Приготовление раствора конъюгата. Готовить непосредственно перед использованием! Количество используемого конъюгата и раствора для разведения конъюгата (РРК), в зависимости от числа стрипов, взятых для анализа, приведено в таблице 1. (см. дополнительную информацию). В отдельный чистый флакон внести необходимое количество РРК, добавить необходимое количество конъюгата и тщательно перемешать. Хранение: до 30 мин при 18-25град. С.

1.6. Приготовление раствора ТМБ. Готовить непосредственно перед использованием! Для проведения анализа на одном стрипе 70 мкл концентрата ТМБ растворить в 1 мл ЦФР в отдельном чистом флаконе (см. таблицу). Следует исключить воздействие света на растворы ТМБ и ЦФР, например, обернуть флакон фольгой. Внимание! Раствор ТМБ должен быть бесцветным. Появление цвета в течение нескольких минут после приготовления раствора указывает на то, что реагент не может использоваться и должен быть заменён. Рекомендуем выделить отдельную посуду и наконечники для пипетки, которые использовать только для работы с раствором ТМБ. После работы посуду и наконечники ополоснуть водой, промыть 70% спиртом и тщательно отмыть дистиллированной водой. Посуду и наконечники пипеток, контактирующие с раствором ТМБ, нельзя отмывать с применением синтетических моющих средств, поскольку даже их следы ведут к неконтролируемому разложению ТМБ в ходе реакции. Хранение: до 20 мин при 18-25 град. С в тёмном месте.

2. ПРОВЕДЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА. Внимание! Внесение контрольных и исследуемых образцов проводить достаточно быстро, в течение 5-7 мин, так как при длительном времени внесения образцов в лунки рабочего планшета времена инкубации первого и последнего образцов значительно отличаются, что может привести к неправильной оценке результатов.

2.1. В лунку А-1 внести 100 мкл раствора для разведения сывороток (РРС). Лунка А-1 будет являться контролем поглощения раствора ТМБ. Для нанесения контрольных образцов рекомендуется следующая схема:

при использовании 1 стрипа - 1 лунка К+ и 2 лунки К-

2 стрипов - 2 лунки К+ и 2 лунки К-

3 и более - 2 лунки К+ и 3 лунки К-

Согласно схеме лунки стрипа, например,В-1, С-1, D-1, Е-1 оставить для внесения контрольных образцов (К- и К+). В остальные лунки внести по 90 мкл РРС и по 10 мкл предварительно разведённых исследуемых сывороток. Таким образом, исследуемая сыворотка в лунке разбавляется в 100 раз. После внесения исследуемых образцов внести по 100 мкл К- и К+. Отрезать липкую плёнку требуемого размера. Стрипы закрыть, плотно прижав плёнку, поместить во влажную камеру. Инкубировать 30+/-3 мин при температуре 37,5+/-0,5 град. С.

2.2 После окончания инкубации осторожно снять плёнку, поместить в дезинфицирующий раствор. Стрипы промыть (см. ниже).

Требования к отмывке: Полностью удалите жидкость из всех ячеек в ёмкость с дезинфицирующим раствором, используя для этого вошер или многоканальную пипетку. После этого заполните все лунки стрипов раствором для отмывки планшета, внося не менее 300 мкл в каждую лунку. Удаление жидкости производится не ранее, чем через 30-60 секунд после её внесения. Повторите данную процедуру еще 4 раза. Общее количество отмывок равно 5. Остатки жидкости на дне лунок и сверху на рамке и стрипах удалите, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге; фильтровальную бумагу необходимо менять после каждой операции.

2.3. В каждую лунку стрипа, кроме А-1, внести по 100 мкл раствора конъюгата (п. 1.5). В лунку А-1 внести 100 мкл РРК. Отрезать плёнку требуемого размера. Стрипы закрыть плёнкой, поместить во влажную камеру. Инкубировать 30+/-3 мин при37,5+/-0,5 град. С. За 5-10 мин до окончания инкубации приготовить раствор ТМБ (п. 1.6).

2.4. По окончании инкубации стрипы промыть как описано в п. 8.2.

2.5. Внести в каждую лунку по 100 мкл раствора ТМБ в ЦФР и инкубировать в темноте в течение 25 мин при 18-25 град. С.

2.6. Остановить реакцию добавлением в лунки по 100 мкл стоп-реагента, используя ту же самую последовательность и скорость раскапывания, что и для раствора ТМБ. Убедитесь в чистоте основания стрипов. В случае загрязнения - тщательно протрите основание стрипов. Стоп-реагент представляет собой раствор серной кислоты с концентрацией 1 моль/л. В случае попадания на кожу стоп-реагента необходимо немедленно смыть его водой с мылом.

2.7. Результаты ИФА регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм. Измерения проводят не позднее 10-15 мин после остановки реакции. Проверьте соответствие между спектрофотометрическими и визуальными данными, а также между распределением проб в планшете и идентификационным протоколом.

3. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Качество тест-системы считают удовлетворительным, если ОП контроля раствора ЦФР не превышает 0,10 о.е., среднее значение ОП отрицательного контрольного образца (ОПср К-) не превышает 0,250 о.е., а среднее значение ОП положительного контрольного образца не менее 0,7 о.е.

3.2. Рассчитывают критическое значение оптической плотности (ОПкрит) по формуле:

ОПкрит = ОПср К- + 0,1.

3.3. Если значение оптической плотности исследуемого образца ОПисл < 0,9xОПкрит, то результат анализа считают отрицательным, IgG к вирусу краснухи не определены. Но это не означает, что пациент не инфицирован вирусом краснухи. Если кровь взята у больного в начале острой фазы заболевания, IgG в сыворотке крови могут отсутствовать, поэтому при подозрении на наличие инфекции (контакт, клинические проявления) рекомендуется исследовать сыворотку на наличие IgM и провести анализ на наличие IgG и IgM сыворотки, взятой у пациента через 10-15 дней.

3.4.Если ОПисл попадает в интервал от 0,9xОПкрит до 1,1xОПкрит, то результат анализа сомнительный. Рекомендуется повторить анализ такой сыворотки. При повторном сомнительном результате необходимо проанализировать сыворотку, полученную через 10-15 дней, параллельно с 1-м образцом сыворотки, чтобы проследить увеличение концентрации IgG. Если ОПисл > 1,1xОПкрит, то результат анализа исследуемого образца считают положительным. Присутствие IgG к вирусу краснухи отражает наличие текущей или перенесенной ранее инфекции.

3.5. Если при анализе парных сывороток образец, взятый в острую фазу, негативный, а образец, взятый в фазу реконвалесценции, позитивный, имеет место сероконверсия, что свидетельствует о первичной инфекции.

3.6. При анализе парных сывороток для контроля изменения концентрации IgG или наличия сероконверсии оба образца должны быть тестированы в дубликате одномоментно во время одной постановки.

3.7. Дополнительный контроль при анализе парных сывороток. Для проверки воспроизводимости анализа обоих образцов, полученных в острой фазе и в период реконвалесценции, необходимо исследовать сыворотки в двух повторах и использовать для оценки качества анализа следующий критерий: соотношение оптических плотностей в первой и второй лунках для каждой сыворотки (ОПл1/ОПл2) при острой фазе или реконвалесценции должно находиться в пределах 0,8-1,2. Процент увеличения концентрации IgG в парных сыворотках определяется по формуле:

% = ОП2 - ОП1 x 100 %

ОП1 где ОП1 - оптическая плотность первого образца; ОП2 - оптическая плотность второго образца, взятого через 10-15 дней.

Интерпретация результатов: Если процент увеличения концентрации IgG в парных сыворотках < 30% - незначительное изменение в концентрации IgG. Отсутствие доказательств недавней инфекции. Если все-таки подозревается острая инфекция, необходимо взять 3-й образец через 10-15 дней и проанализировать все 3 образца параллельно, чтобы убедиться в увеличении концентрации IgG. >30% - статистически достоверное увеличение концентрации IgG. Это идентифицирует тех людей, которые недавно перенесли первичную инфекцию или в настоящее время у этих пациентов протекает реинфекция или реактивация. При количественной оценке результатов расчет концентрации анти-RV-IgG в исследуемой сыворотке в МЕ/мл производится по формуле:

МЕ/мл = ОПиссл x С x K

ОПcp K+

где ОПисл - значение поглощения исследуемой сыворотки; ОПсрК+ - среднее значение поглощения контрольного образца; С - величина концентрации в МЕ/мл в данной серии контрольного образца (указана на флаконе); К - коэффициент коррекции, т. к. при значении оптической плотности > 1,5 о.е. увеличение ОП в исследуемых образцах не прямо пропорционально увеличению концентрации антител (см. таблицу 2). Если значение ОПисл превышает 3,5 о. е., исследуемый образец рекомендуется предварительно развести в 2 или 4 раза однократным раствором ФСБ-Т и анализировать повторно согласно схеме проведения ИФА.

Таблица 2

ОПисл К ОПисл К

0,000-1,500 1,00 2,851-2,900 1,75

1,501-2,000 1,10 2,901-2,950 1,80

2,001-2,100 1,20 2,951-3,000 1,85

2,101-2,200 1,25 3,001-3,050 1,90

2,201-2,300 1,30 3,051-3,100 1,95

2,301-2,400 1,35 3,101-3,150 2,00

2,401-2,500 1,40 3,151-3,200 2,05

2,501-2,600 1,45 3,201-3,250 2,10

2,601-2,650 1,50 3,251-3,300 2,15

2,651-2,700 1,55 3,301-3,350 2,20

2,701-2,750 1,60 3,351-3,400 2,25

2,751-2,800 1,65 3,401-3,450 2,30

2,801-2,850 1,70 3,451-3,500 2,35

Примечание: Необходимо отметить, что при определении иммуного статуса положительный результат анализа IgG не исключает возможность текущей инфекции. Поэтому для подтверждения текущей инфекции необходимо исследовать эту сыворотку на наличие IgM к вирусу краснухи, используя набор "ВектоРубелла-IgM-стрип" (кат. N D-2554). Следует иметь в виду, что при низкой концентрации (10-25 МЕ/мл) специфические иммуноглобулины не всегда способны обеспечить полную защиту при повторном инфицировании, и пациенты с таким уровнем концентрации IgG могут быть отнесены к группе риска в отношении реинфекции вирусом краснухи.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА АНТИТЕЛ В ВЫЯВЛЕННЫХ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ОБРАЗЦАХ Если необходимо определить титр антител в выявленных положительных образцах, непосредственно перед основной реакцией проводят титрование исследуемых сывороток следующим образом: В лунку А-1 внести 100 мкл РРС (контроль поглощения раствора ЦФР), в лунки В-1, С-1, D-1 внести по 100 мкл К-, в лунки E-1 и F-1 - по 100 мкл К+. В остальные лунки верхнего ряда А-2 - А-12 внести по 180 мкл РРС и по 20 мкл предварительно разведённых исследуемых сывороток, перемешать пипетированием. Во все оставшиеся лунки внести по 100 мкл РРС. Многоканальной пипеткой перенести по 100 мкл разведённых сывороток из лунок верхнего ряда в лунки 2го ряда, перемешать (контрольные образцы не титровать). Из лунок 2го ряда - в лунки 3го ряда, перемешать. Так же последовательно переносить до последнего ряда. Из последнего ряда сбросить по 100 мкл содержимого лунок. Таким образом, в вертикальных рядах получают последовательные 2-кратные разведения исследуемых сывороток. Планшет закрыть и поместить во влажную камеру, инкубировать при 37,5+/-0,5 град. С в течение 30+/-3 мин. Дальнейший ход анализа аналогичен вышеописанному для выявления положительных сывороток. Результаты анализа оценивают аналогично вышеописанному. Титром считают последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором ОП в соответствующей лунке на 0,1 единицы превышает ОПср К-.

Срок годности:

6 месяцев со дня выпуска.

Условия хранения:

Тест-систему хранят при температуре 2-10 град. С. Транспортирование осуществляют всеми видами крытого транспорта в тех же температурных условиях.

Дата актуализации инструкции 06.02.2008

Производитель: Вектор-Бест ЗАО, Россия

Владелец регистрационного удостоверения: Вектор-Бест ЗАО, Россия

Формы выпуска: набор диагностический многокомпонентный, упаковки комбинированные

Данные гос. регистрации: Р N003276/01 от 05.03.2004

Состояние регистрационного удостоверения: дата аннулирования 28.08.2009

Номер фармстатьи: ФСП 42-0117-4696-03