Перспективы развития клеточных технологий: стволовые клетки (М.А. Пальцев, В.Н. Смирнов, "Ремедиум", N 10, октябрь 2005 г.)

Перспективы развития клеточных технологий: стволовые клетки

Проблема использования стволовых клеток - одна из самых актуальных в настоящее время. Основные вопросы, которые обсуждают специалисты: целесообразно ли с медицинской точки зрения и этично ли применять стволовые клетки в настоящее время, если да - то в какие именно и в каких случаях, достаточно ли доказательств эффективности соответствующих технологий, правомерно ли проводить масштабные клинические исследования таких методов лечения.

Всеобщее внимание к проблеме подогревается активными рекламными кампаниями, обещающими чудодейственный эффект. Медицинское сообщество не может не волновать столь неожиданное развитие процесса научных изысканий в области стволовых клеток (СК), а именно спекуляции на перспективной проблематике с единственной целью получения коммерческой выгоды. Между тем рекламные предложения с помощью стволовых клеток провести комплексное омоложение организма, а также вылечить импотенцию, цирроз печени, рассеянный склероз, болезни Паркинсона и Альцгеймера, заболевания мозга, все виды онкологических заболеваний и даже задержку психо-речевого развития у детей эксплуатируют те же идеи, что практиковались во второй половине XIX века. Основателем этого направления был Brown-Seguard'a. Главный принцип его учения - подобное лечится подобным, т.е. если взять от молодого кролика кусочки печени и подшить их под кожу больного пациента, то можно вылечить его печень. Разница сегодняшнего дня с XIX веком одна: тогда использовались ткани животных, а сейчас - человеческий материал, но принцип точно такой же: если ввести больному клетки глаза от развивающегося эмбриона, что больной глаз у пациента будет вылечен. Однако столь механистические подходы не выдерживают серьезной критики.

Кроме того, преждевременные попытки применения в клинике эмбриональных стволовых клеток и фетальных тканей, как правило, обречены на неудачу, а значит, вредны для пациентов. Особую тревогу вселяют полулегальная практика применения этих материалов: если они не проверены должным образом, пациент может быть инфицирован микоплазмой, цитомегаловирусом или герпесом. Но даже применение чистого эмбрионального материала нередко через некоторое время вызывает отторжение этих эмбриональных клеток. Существует и такое серьезное возражение против применения в клинике непроверенных эмбриональных клеток, как малигнизация и образование тератом. Наконец, клиническое использование эмбриональных стволовых клеток и фетальных тканей представляет собой большую этическую проблему.

Сегодня в клинике реально используются постнатальные СК. Основным источником служит аутологичный костный мозг пациента. Как правило, это смесь гемопоэтических (кроветворных) клеток и мезенхимальных клеток (клеток субстрата - опорной ткани) костного мозга, среди которых есть стволовые. Используется также собственная жировая ткань пациента, где также содержатся в основном мезенхимальные СК. Кроме того, используются донорские, мезенхимальные клетки, размноженные в культуре. Но на первый план выдвигается пуповинная кровь, в ней содержится смесь клеток, которые можно использовать при трансплантации, заменяя при этом донорство костного мозга.

Существуют убедительные примеры, говорящие о том, что постнатальные СК костного мозга обладают пластичностью, достаточной для восстановления различных тканей после ишемического повреждения, например сетчатки, почки, сердечной ткани.

Кардиология

Кардиология имеет наибольший опыт применения стволовых клеток.

В конце XX - начале XXI веков достигнут предел улучшения выживаемости больных с поврежденным миокардом с помощью медикаментозных и/или хирургических методов, возможности фармакологии практически полностью исчерпаны. Между тем только в США ежегодно регистрируется 1,1 млн. инфарктов миокарда; 550 тыс. новых случаев сердечной недостаточности; 300 тыс. смертей от сердечной недостаточности; 750 тыс. операций аорто-коронарного шунтирования и 1,8 млн. операций баллонной ангиопластики, пересадки сердца ждут 60 тыс. больных, но наличие донорских сердец составляет всего 2 тыс. Ученые всего мира ищут новые способы оказания помощи таким больным. То есть назрела необходимость поиска новых путей воздействия, не связанных с улучшением лекарственного препарата или оперативного вмешательства.

Общая концепция первых работ в США по использованию СК в кардиологии была следующей. При возникновении инфаркта миокарда гибнущая ткань и окружающие ее ткани выделяют смесь из химических сигналов, которые поступают в кровь. В основном, это смесь цитокиновой природы, которая с кровотоком проходит через костный мозг и вызывает высвобождение различных стволовых клеток (кроветворных и мезенхимальных). Если в зоне инфаркта еще сохранен кровоток, то СК вместе с кровью останавливаются в окружающей периинфарктной зоне.

Уже в первых работах на мышах было показано, что эти мезенхимальные клетки способны дифференцироваться в кардиомиоциты, в гладкомышечные клетки капилляров и артериол, в клетки электрической системы сердца. Эти работы вызвали бурю возражений классических эмбриологов, которые утверждали, что подобные трансдифференцировки невозможны.

Но исходная идея оказалась настолько привлекательной, что начались немедленные, особенно в Германии, мультицентровые клинические исследования. Они давали кардиологам хоть какую-то надежду на спасение практически безнадежных больных. В одной из недавно опубликованных работ показаны результаты мониторирования судьбы введенных костно-мозговых клеток (КК) у человека с помощью позитронного томографа. Как минимум по пяти критериям были получены доказательства того, что введенные костно-мозговые предшественники превратились в кардиомиоциты, т.е. произошла трансдифференцировка, а не слияние введенных клеток с кардиомиоцитами. Хотя судьба мезенхимальных клеток не исследовалась и введение фракции клеток костного мозга, обогащенной мезенхимальными клетками, не проводилось.

Назовем типы клеток, применявшихся в клинической кардиологии. Закончены испытания с эмбриональными СК. Они больше не используются по причинам, о которых сказано выше. Пятнадцать лет проводились испытания аутологичных миобластов, - введенных в сердце СК, выращенных в культуре из кусочка собственной мышечной ткани. Практика показала, что миобласты не образуют электрического сопряжения с существующей тканью, поэтому их введение очень часто вызывает злокачественную аритмию. Вследствие этого современные трансплантации миобластов идут только на фоне установленного водителя ритма. Самое большое распространение сегодня получило использование мононуклеаров аутологичного костного мозга: пациенту в течение нескольких дней после инфаркта вводят мононуклеары костного мозга. В настоящее время в Европе идут четыре группы мультицентровых испытаний по введению собственных мононуклеаров. Окончательные результаты пока не опубликованы, но предварительные данные положительноые.

Используются также аутологичные мезенхимальные стволовые клетки. Они способны давать в культуре большую массу без дифференцировки, оставляя впереди некоторое число делений для того, чтобы довольно долго работать в организме после введения. Кроме того, аутологичные мезенхимальные клетки представляют собой достаточно чистый материал для кинических исследований, разрешенный FDA. Наконец, FDA разрешило ускоренное испытание аллогенных мезенхимальных клеток. Как оказалось, эти клетки, полученные от молодых доноров, можно использовать для других пациентов, поскольку они обладают определенными свойствами, отключающими локально иммунную систему и предотвращающими отторжение. То есть, аллогенные мезенхимальные клетки действуют в качестве лекарственного препарата. Количество клеток, которое удается получить примерно из 20 см3 костного мозга, исчисляется миллиардами, а это тысячи спасенных пациентов.

Как правило, в Европе используется внутрикоронарная инфузия аутологичных мезенхимальных СК. В 2004 г.такие клетки были введены примерно 250 пациентам с инфарктом миокарда и больше чем 50 пациентам с сердечной недостаточностью.

В настоящее время все более популярной становится NOGA-технология - метод введения аутологичных клеток костного мозга или мезенхимальных клеток из культуры, которая прошла все разрешения, внутрь стенки левого желудочка. Процедура проводится амбулаторно в течение одного дня. Сначала у пациента забирают костный мозг, очищают его. Пациенту с помощью специального устройства в левый желудочек вводится катетер, несущий на конце микромагнит. В магнитном поле положение микромагнита определяется с точностью до 1 мм. Катетер проходит приблизительно по 50 зонам стенки левого желудочка, получая электрические характеристики для каждого участка, которые коррелируют с сократимостью. Компьютер строит карту, и консилиум врачей решает, куда следует вводить аутологичные СК. Эта зона должна иметь сниженную способность к сокращению, но в то же время не должна быть полностью не сокращающейся. Затем катетер заменяется на другой, на конце которого находится не только магнит, но и шприц, через который суспензия из СК вводится в заранее намеченные точки. Эта процедура достаточно безболезненна, делается без общего наркоза и занимает в общей сложности 1,5 часа. Пациент приходит в себя до конца дня и вечером выписывается.

Эта технология применяется пока у пациентов, которым не остается ничего другого, - все они стоят в очереди на пересадку сердца. Средняя эффективность подобной однократной процедуры - увеличение на 9% индекса сократимости, что гарантирует пациенту с сердечной недостаточностью 2 года жизни. Усилия того стоят, ибо есть надежда, что пациент все же дождется своей очереди на пересадку сердца.

FDA в США разрешило испытания в клинике мононуклеаров и аутологичных мезенхимальных СК, безопасность и эффективность которых была подтверждена. Вопрос об использовании донорских (аллогенных) клеток у людей, перенесших инфаркт, остается открытым до окончания клинических испытаний, которые проводятся на базе университета в Балтиморе и займут примерно год.

Травматология и ортопедия

Об остроте проблемы снова скажет статистика (США, 2002 г.): 6 млн. переломов трубчатых костей, из которых 300 тыс. случаев несрастания, требующих повторного вмешательства; 285 тыс. операций на позвоночнике; 500 тыс. операций в челюстно-лицевой хирургии; 800 тыс. операций на менисках. Эти данные вполне соотносимы с российскими.

В апреле 2005 г. FDA разрешило первые контролируемые клинические исследования линий мезенхимальных клеток для восстановления менисков у группы из 48 пациентов. Речь идет о простом введении клеток в суставную коленную сумку и поврежденный мениск.

Для реконструктивной хирургии при больших костных дефектах предлагается метод с применением искусственно трансформированных СК. Трансформация клеток проводится двумя генами костных морфогенетических белков ВМР-2 и ВМР-7, которые участвуют в строительстве кости. Оказалось, что когда эти 2 гена присутствуют в мезенхимальных клетках, то эти клетки можно посадить на соответствующий носитель (гидроксиапатит), который затем вживляется в кость. Восстановление костной ткани идет примерно в 10 раз быстрее. Если в США применение остеобластов практически доступно, то в России цена на них пока еще достаточно высока.

Наконец, начаты исследования и получены первые данные об использовании мезенхимальных клеток для восстановления межпозвонковых дисков. Межпозвонковые диски по клеткам и по экспрессии генов в этих клетках сильно отличаются от хондроцитов гиалинового хряща, формирующего суставные поверхности. Индуцировать нужное направление экспрессии генов и нужных белков пока удается только в культуре МК при добавлении нужных факторов. Особенно важен этот метод для пожилых людей, у которых проблема заживления стоит очень остро.

Неврология

Вновь обратимся к статистике (США, 2002 г.): 750 тыс. инсультов ежегодно; 270 тыс. травм головного мозга; 250 тыс. травм спинного мозга. Общие затраты на лечение и содержание пациентов - 100 млрд. долл. в год.

К сожалению, надежных сведений о лечении таких пациентов с помощью инфузий СК пока не получено, несмотря на довольно активное применение этого метода.

Сенсационные данные публикуют о лечении спинальных больных - несколько пациентов пролечено в Корее.

В экспериментах in vitro доказана трансдифференцировка мезенхимальных СК в нейроны и нейроглию. В опытах на животных (модель инсульта) выявлена положительная неврологическая динамика после введения клеток пуповинной крови и клеток, выделенных из ткани пуповины (Вартониева студня). Очевидно, в ближайшем будущем начнутся клинические исследования. И в этом есть смысл, поскольку никакой реальной помощи инсультным больным медицина пока оказывать не научилась.

Онкология

В онкогематологии источниками стволовых клеток для трансплантации являются донорский костный мозг, аутологичная периферическая кровь после стимуляции колониестимулирующими факторами и пуповинная донорская или аутологичная кровь.

На первое место по перспективности использования в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации выходит пуповинная кровь (ПК). Эффекты применения ПК испытаны на 53 заболеваниях. К патологиям, при лечении которых применяется трансплантация СК пуповинной крови, относятся злокачественные новообразования и лейкозы как у детей, так и у взрослых, гемоглобинопатии и болезни крови, врожденные нарушения обмена, а также аутоиммунные заболевания. В перспективе, по-видимому, к ним добавятся заболевания сердечно-сосудистой системы, нейродегенеративные заболевания и травмы головного и спинного мозга.

Перспективы развития клеточных технологий

Создание криобанков стволовых клеток во всех развитых странах мира представляется очень перспективным делом. В связи с этим России также предстоит решить, по крайней мере, две задачи: во-первых, создать регистр "именных" и донорских стволовых клеток крови пуповины/плаценты, а во-вторых, вести выделение, наращивание и хранение биомассы аутологичных или донорских мезенхимальных стволовых клеток для последующего клинического использования. Поскольку в стране отсутствуют доноры костного мозга, то единственное, на что можно рассчитывать - это пуповина и пуповинная кровь. Для того чтобы обеспечить потребности страны в трансплантации костного мозга (12 тыс. больных лейкозами в год), требуются 100 тыс. тщательно обследованных и безымянных образцов пуповинной крови, - именно такое количество пуповин ежегодно уничтожается при родах в одной только Москве.

Как уже говорилось, FDA разрешила клинические исследования аутологичных мезенхимальных СК и готова дать разрешение на применение и аллогенных, т.е. донорских, мезенхимальных СК. Это связано с тем, что с возрастом количество аутологичных стволовых клеток в костном мозге резко уменьшается (при рождении у человека соотношение стволовых и обычных клеток крови составляет 1:10 000, а к 80 годам - 1:20 00 000). Поэтому возникает закономерный вопрос: будем ли мы использовать собственные СК или применять при различных заболеваниях средство в виде аллогенных мезенхимальных клеток? То, что сейчас лежит в основе применения или попыток применения при разных заболеваниях донорских СК, - это их иммунопривилегированность, т.е. отсутствие иммунного ответа на них. "Отсутствие ответа на мезенхимальные стволовые клетки опосредованного Т-лимфоцитами in vitro и отсутствие иммунного ответа на трансплантированные мезенхимальные СК in vivo говорит о том, что эти МК являются иммунопривилегированными и могут использоваться аллогенно" (M.F.Pittenger, Graft, 2000). Последнее утверждение, по-видимому, является причиной того, почему FDA дала разрешение на испытания применения мезенхимальных СК для снятия реакций отторжения после трансплантаций костного мозга и трансплантации органов.

Первое лекарственное средство из СК - Прохимал - представляет собой выращенные мезенхимальные стволовые клетки донора. Доказано, что введение этого препарата препятствует отторжению трансплантата и возникновению болезни "трансплантат-против-хозяина", поскольку под воздействием этих клеток иммунная система затормаживается.

Наконец, нельзя не упомянуть о побочных эффектах "природной" клеточной терапии. Когда повреждается стенка сосуда, к ней устремляется большое количество различных клеток крови костно-мозгового происхождения, а также стромальные клетки костного мозга. Индуцируется воспалительно-репаративный процесс, который нередко заканчивается образованием атеросклеротической бляшки. Ученым Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росздрава удалось доказать, что значительная часть фиброза, связанного с бляшкой, вызывается естественным, т.е. не навязанным извне, действием мезенхимальных СК.

Известно, что регенерация слизистой оболочки желудка в ответ на воспаление происходит с участием стволовых клеток костно-мозгового происхождения. Побочным эффектом подобной "клеточной терапии", не специально индуцированной, а естественно идущей в организме за счет внутренних резервов, может явиться развитие полипов и опухолей.

Крайне осторожным нужно быть при культивировании стволовых клеток. Доказано, что мезенхимальные стволовые клетки, прошедшие в культуре более 90-140 удвоений, способны перерождаться в раковые.

Безусловно, ученые возлагают очень большие надежды на использование стволовых клеток для лечения различных заболеваний. Проблема на сегодняшний день состоит в том, что существует масса утверждений об их эффективности и нет ни одного доказательства их успешного клинического применения двойным слепым методом. Для "цивилизованного" развития клеточных технологий в Российской Федерации предстоит сделать еще очень много: разработать законодательную базу, провести сертификацию технологий и лицензирование пользователей, но самое главное - организовать проведение клинических испытаний.

М.А. Пальцев,

ММА им. И.М.Сеченова

В.Н. Смирнов,

Институт экспериментальной кардиологии Российского

кардиологического научно-производственного комплекса

"Ремедиум", N 10, октябрь 2005 г.