Межгосударственный стандарт ГОСТ 25311-82 "Мука кормовая животного происхождения. Методы бактериологического анализа" (утв. постановлением Госстандарта СССР от 17 июня 1982 г. N 2421)

Feeding flour of animal origin. Methods of bacteriological analysis

Дата введения 1 июля 1983 г.
Введен впервые

Настоящий стандарт распространяется на кормовую муку животного происхождения и устанавливает методы бактериологического анализа:

определение общего количества микробов;

определение присутствия бактерий группы кишечной палочки;

определение присутствия бактерий из рода сальмонелл;

определение присутствия бактерий анаэробов.

1. Отбор и подготовка проб

1.1. Отбор проб для бактериологического анализа проводят по ГОСТ 17536 сухим стерильным щупом в сухую стерильную стеклянную банку.

1.2. Масса точечной пробы должна быть не менее 100 г. Масса объединенной пробы должна быть не менее 500 г.

1.3. Объединенную пробу тщательно перемешивают и делят пополам. Каждую часть упаковывают в стерильную стеклянную банку. Одну банку направляют в лабораторию, а другую сохраняют на предприятии до окончания анализа.

1.4. При отборе проб составляют акты в двух экземплярах, которые должны содержать следующие данные: наименование предприятия-изготовителя, номер партии, вид и массу продукта, количество упаковочных единиц, дату изготовления продукции и отбора проб.

2. Аппаратура, материалы, реактивы

2.1. Для проведения бактериологических анализов применяют следующие аппаратуру, материалы и реактивы:

автоклав;

анаэростат;

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;

гомогенизатор бактериологический, смеситель или аппарат для измельчения тканей с частотой вращения не менее 8000 об./мин;

дистиллятор;

лупы измерительные с увеличением и по ГОСТ 25706;

лампы ртутно-кварцевые;

микроскоп марок МБИ и МБР по НТД или других аналогичных марок;

мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;

потенциометр по ГОСТ 7164;

прибор для подсчета колоний;

термостат электрический с автоматическим терморегулятором;

холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317;

шкаф сушильный лабораторный;

агар микробиологический по ГОСТ 17206;

агар сухой с эозином метиленовым синим (среда Левина);

агар Эндо сухой бактериологический;

агар Плоскирева сухой бактериологический;

агар сухой висмут-сульфит;

альфанафтиламин по НТД;

алхилбензолсульфонат;

баню водяную с терморегулятором;

бульон мясопептонный по ГОСТ 20730;

бумагу парафинированную по ГОСТ 9569;

бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;

воду мясную по ГОСТ 20729;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

воронки стеклянные по ГОСТ 25336;

дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171;

желатин пищевой по ГОСТ 11293;

колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;

кристаллизатор с мостиком;

марлю бытовую по ГОСТ 11109;

марлю медицинскую по ГОСТ 9412;

масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;

масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164;

мел химический осажденный по ГОСТ 8253;

мясо - говядину по ГОСТ 779;

ГАРАНТ:

Приказом Росстандарта от 11 апреля 2011 г. N 43-ст применение ГОСТ 779-55 прекращено на территории РФ с 1 января 2013 г. в связи с утверждением и введением в действие ГОСТ Р 54315-2011

набор углеводов для исследования ферментации микробов кишечной группы (большой);

набор адсорбированных поливалентных сальмонеллезных 0-сывороток основных пяти групп (А, В, С, Д, Е) и редких групп;

набор 0-моно и поливалентных агглютинирующих колисывороток;

палочки стеклянные;

парафин по ГОСТ 23683;

пептон венгерский фирмы "Рихтер", чешский "Спофа";

пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;

песок кварцевый для тонкой керамики по ГОСТ 7031;

печень говяжью;

пинцеты для предметных стекол;

пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10  с ценой деления 0,1  с широким концом;

пипетки Мора вместимостью 25, 50 ;

пипетки пастеровские;

поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм и диаметром 5, 9 и 10 мм соответственно;

препарат с индикатором ВР и глюкозой;

пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336;

пробки корковые по ГОСТ 5541;

пробки резиновые конусные по НТД;

проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3-0,5 мм по ГОСТ 1791;

стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672;

стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284;

ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147;

среду КОДА сухую питательную;

флаконы Сокслета;

цилиндры мерные наливные 1-100, 1-250, 1-500 по ГОСТ 1770;

колбы мерные наливные 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2 по ГОСТ 1770;

часы песочные на 1, 2, 5 мин;

чашки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 типа ЧБН (чашки Петри);

шпатели Дригальского;

штативы для пробирок;

шумовку;

яйца куриные;

бриллиантовый зеленый;

бромкрезолпурпур;

бромтимоловый синий;

геницианвиолет;

глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;

глюкозу кристаллическую гидратную по ГОСТ 975, х.ч.;

железо хлористое по ГОСТ 4147;

йод по ГОСТ 4159, х.ч.;

калий йодистый по ГОСТ 4232;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.;

калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493, ч.д.а.;

калий едкий;

кальций углекислый по ГОСТ 4530;

кислоту розоловую;

кислоту щавелевую;

кислоту сульфаниловую по ГОСТ 5821;

лактозу, х.ч.;

магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4209, х.ч.;

магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523;

маннит по НТД, х.ч.;

метиленовый голубой;

мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

сахарозу по ГОСТ 5833, х.ч.;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962**;

спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;

фенолрот;

фуксин основной для микробиологических целей;

фуксин (основной и кислый) для микробиологических целей;

хинозол;

натрий сернистокислый безводный по ГОСТ 195.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3. Подготовка к анализу

3.1. Приготовление питательных сред: пептонной воды, мясопептонного агара (МПА), сред Эндо, Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука, Киллиана, Кауфмана, Мюллера, магниевой среды, селенитового бульона, Гисса, "ХБ" (хинозол-бромкрезол-пурпуровый), хлористо-магниевой среды "М" (модифицированной), среды Хейфеца, Булира, Кесслера, Эйкмана, Левина, Ресселя, Плоскирева, висмут-сульфит агара, КОДА, Крумвиде-Олькеницкого, полужидкого агара, кровяного агара по Цейслеру, среды Китт-Тароцци, короткого пестрого ряда среды Вильсон-Блера - производят по ГОСТ 9958, ГОСТ 18963, ГОСТ 21237 и по методикам, утвержденным в установленном порядке.

ГАРАНТ:

Приказом Росстандарта от 12 июля 2011 г. N 180-ст применение ГОСТ 9958-81 прекращено на территории РФ с 1 января 2013 г. в связи с утверждением и введением в действие ГОСТ Р 54354-2011

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.2. Приготовление испытуемой взвеси и разведений

От общей пробы отвешивают на лабораторных весах навеску массой 50 г и помещают ее в стерильную колбу или стакан гомогенизатора, содержащий 450  стерильного физиологического раствора, и тщательно перемешивают в течение 30 мин, получая основное десятикратное разведение. После отстаивания в течение 10-15 мин из надосадочного слоя берут пипеткой 1  жидкости, вносят в пробирку с 9  стерильного физиологического раствора и получают последующее разведение. Из этой пробирки готовят последующие разведения (тысячекратное и т.д.).

4. Проведение анализа

4.1. Определение общего количества микробов в 1 г муки

4.1.1. Метод основан на способности живых бактериальных клеток образовывать макроколонии при оптимальных условиях культивирования на питательных средах.

4.1.2. По 1  каждого разведения вносят в стерильные бактериологические чашки и заливают 10-15  стерильного, расплавленного и охлажденного до 45°С мясопептонного агара. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре на 72 ч.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.1.3. Обработка результатов

Выросшие на чашках колонии подсчитывают, умножают на кратность соответствующего разведения. За общее количество микроорганизмов в 1 г муки принимают среднее арифметическое результатов двух смежных разведений.

4.2. Определение присутствия бактерий группы кишечной палочки

4.2.1. Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять маннит и лактозу, образовывать на средах "ХБ" и Хейфеца кислые продукты, изменяющие цвет индикаторов, входящих в состав этих сред.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2.2. По 1  каждого разведения вносят (по выбору) в пробирки, содержащие по 5  среды: Эйкмана, Кесслер, Булира, Хейфеца, "ХБ" или КОДА. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С для первых пяти сред и 37°С для последней.

4.2.3. Через 24 ч учитывают рост на средах Эйкмана, Булира по помутнению среды и образованию газа, на средах Хейфеца, "ХБ" и КОДА - по изменению цвета сред.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2.4. Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев в количестве 0,1-0,2  на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина) и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч.

Типичные колонии Е. Coli характеризуются круглой формой, выпуклой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо и фиолетового или черного - на среде Левина.

Выросшие изолированные колонии (не менее 4) пересевают на мясопептонный бульон, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей, вторую - для приготовления кипяченого антигена.

4.2.5. У выделенных культур изучают морфологические, культурально-биохимические и патогенные свойства с целью проведения их родовой дифференциации. Культурально-биохимические свойства изучают по комплексу ЛИМАЦ (лактоза + индол + метилрот + реакция фогес Проскауэра -, цитратно-аммонийные соли +).

Одновременно с определением морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств бактерий проводят серологическую типизацию культур кишечной палочки по 0-антигену.

Для приготовления антигена каждую предназначенную для типизации суточную агаровую культуру (пробирку со скошенным агаром) смывают стерильным физиологическим раствором, доводят суспензию бактерий до концентрации 5-6 , кипятят в водяной бане в течение 1 ч и ставят реакцию агглютинации на стекле с комплексной 0-сывороткой, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:5.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2.6. Если комплексные 0-колисыворотки в начальной реакции не агглютинируют антиген из убитой нагреванием культуры, то готовят из этого штамма суспензию бактерий и автоклавируют ее при давлении  Па (1 атм) в течение 2 ч для разрушения термостабильного А-антигена. Автоклавированный антиген исследуют с сыворотками 08, 09, 0101.

4.2.7. Обработка результатов

При наличии агглютинации дают заключение о присутствии в исследуемой муке энтеропатогенных типов Е. Coli.

Кроме этого, энтеропатогенными признают культуры Е. Coli, которые:

серологически типизируются набором типоспецифических колисывороток, но не вызывают гибель белых мышей;

серологически не типизируются, но вызывают гибель белых мышей.

4.3. Определение присутствия бактерий из рода сальмонелл

4.3.1. Метод выявления сальмонелл основан на определении их характерного роста на элективных средах и установлении ферментативных и серологических свойств.

4.3.2. Навеску муки массой от 50 до 200 г помещают в колбу, содержащую одну из сред предварительного обогащения (физиологический раствор, пептонная вода) при соотношении муки и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37°С. Через 16-18 ч производят посевы на две (по выбору) основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Киллиана, Мюллера, Кауфмана) в соотношении 1:5.

После 16-18 ч термостатирования при температуре 37°С из обогатительных сред бактериологической петлей производят посевы в чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами висмут-сульфит агар, среды Плоскирева или Левина (по две чашки), которые помещают в термостат при температуре 37°С.

4.3.3. Засеянные чашки просматривают через 24-48 ч.

На висмут-сульфит агаре S. typhi, S. paratyphi А растут в виде мелких, нежных серовато-зеленых колоний с черным центром; S. Cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией - черный.

На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых колоний; на среде Левина - прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые колонии.

При обнаружении колоний, подозрительных на сальмонеллы, три-пять из них засевают на комбинированные среды: Расселя, Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука или трехсахарную (лактоза, глюкоза, сахароза) "скошенный столбик" с мочевиной.

Высев колоний делают на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой, а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода.

Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию - испытанию в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой.

4.3.4. Обработка результатов

Обнаружение подвижных (кроме S. pullorum, S. gallinarum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S. typhi suis не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.

4.3.3, 4.3.4. (Измененная редакция, Изм. N 1).

4.4. Определение присутствия бактерий анаэробов

4.4.1. Метод основан на способности анаэробов расти в отсутствие кислорода воздуха, морфологии возбудителей, росте на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.

4.4.2. В пробирки со средами Китт-Тароцци и Вильсон-Блера и в чашки с кровяным агаром по Цейслеру вносят по 1  первых трех разведений испытуемой взвеси, помещают в термостат и инкубируют при температуре в течение 24-48 ч.

Почернение среды Вильсон-Блера, а также быстрое начало роста на среде Китт-Тароцци при обильном газообразовании является характерным для С. perfringens. На кровяном агаре через 24 ч поверхность колоний С. perfringens слегка выпуклая, округлая, продолговатая, сочные колонии от серого до зеленого цвета, окружены большой зеленовато-коричневой зоной гемолиза. В мазках, приготовленных с кровяного агара, хорошо выражены капсулы и центрально расположенные, крупные овальные, по объему превышающие ширину палочки, споры. Биологическую пробу проводят на морских свинках и белых мышах путем внутрибрюшного заражения двухсуточной бульонной культурой. При положительном результате подопытные животные гибнут через 2-3 сут. Рост С. botulinum наблюдается на 2-3 сут и характеризуется помутнением среды Китт-Тароцци, образованием осадка и запахом прогорклого масла. При исследовании на наличие токсина берут навеску муки массой не менее 50 г, помещают в колбу, содержащую стерильный физиологический раствор в соотношении 1:4. Подготовленный материал настаивают в течение 2-3 ч, затем центрифугируют и центрифугатом заражают внутрибрюшинно или подкожно морских свинок в дозе 1-2  или белых мышей в дозе 0,2-0,3 . Контрольным животным вводят подогретый на водяной бане при температуре 100°С в течение 30 мин центрифугат в тех же дозах.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.4.3. Обработка результатов

Наиболее характерные признаки роста С. perfringens - почернение среды Вильсон-Блера, интенсивный рост на среде Китт-Тароцци с обильным образованием газа, слегка выпуклые, круглые или продолговатые колонии серо-зеленоватого цвета на кровяном агаре. Биопробу считают положительной, когда подопытные животные погибают в течение двух суток после введения им центрифугата, не подвергнутого кипячению.

______________________________

* С 1 июля 2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001.

** В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.