Приложение Г (рекомендуемое). Тесты для определения принадлежности микроорганизмов к определенной группе

Приложение Г
(рекомендуемое)

Тесты для определения принадлежности микроорганизмов к определенной группе

Г.1 Определение каталазной активности

Присутствие каталазы определяют в посевах на любой питательной среде, кроме приготовленной с добавлением крови, по способности каталазы разлагать перекись водорода с выделением пузырьков газа. Если в посевах на агаризованной среде обнаружено несколько типов колоний, то исследование на каталазу проводят с каждым типом колоний. Реакцию ставят с охлажденной до комнатной температуры культурой, содержащей микроорганизмы не старше 24-часового возраста (мертвые клетки искажают результаты), не допуская соприкосновения клеток с нагретой поверхностью и применяя обезжиренные стерильные пробирки, предметные стекла, пипетки одним из способов, указанных ниже.

На колонию микроорганизмов, взятую с поверхности питательной среды, или извлеченную из нее и помещенную на предметное стекло после 30 мин выдержки на воздухе пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода.

Из посевов отбирают 2-3  культуральной жидкости, переносят ее в пробирку и нейтрализуют раствором гидроокиси натрия или соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. 1-2 капли нейтрализованной культуральной жидкости пипеткой переносят на предметное стекло и после 30 мин выдержки на воздухе добавляют к ней каплю 3%-ного раствора перекиси водорода.

Если через 30-60 с на стекле появляются пузырьки газа, то считают, что они образовались в результате разложения перекиси водорода каталазой, образуемой микроорганизмами.

Если в посевах обнаружены газообразующие микроорганизмы, то при определении их каталазной активности ставят контрольную пробу аналогично пробе на каталазу, но без добавления перекиси водорода. Газообразующие микроорганизмы относят к каталазоположительным при отсутствии пузырьков газа в контрольной пробе или при явно повышенном газообразовании в пробе с перекисью водорода по сравнению с контрольной пробой.

Мезофильные и термофильные бациллы образуют каталазу, мезофильные и термофильные клостридии не образуют каталазу, молочнокислые микроорганизмы каталазу не образуют, но разложение перекиси водорода у молочнокислых микроорганизмов рода Pediococcus возможно за счет фермента псевдокаталазы. Определение псевдокаталазы у микроорганизмов неспорообразующих, грамположительных, неподвижных проводят по ГОСТ 10444.11.

Г.2 Микроскопирование посевов

Микроскопируют мазки, приготовленные из первичных посевов. Если при микроскопировании возникает сомнение в однотипности обнаруженных микроорганизмов, то микроскопируют мазки, приготовленные из каждого типа колоний, обнаруженных в посевах на агаризованные среды.

Г.2.1 Путем микроскопирования устанавливают морфологию клеток, наличие и тип спор, присутствие глобул в бациллярных клетках, способность бактерий окрашиваться по Граму. Микроскопируют мазки, окрашенные фуксином и (или) малахитовой зеленью и сафранином, и (или) окрашенные по Граму, и (или) препараты живых микроорганизмов способом фазового контраста. Для установления принадлежности к группе B.cereus определяют присутствие в бациллярных клетках глобул в препаратах, приготовленных из посевов на мясо-пептонном агаре, содержащем 0,1% глюкозы. Присутствие спорообразующих бактерий устанавливают в препаратах культур любого возраста, отсутствие - по результатам просмотра пятидневной культуры. Для окраски по Граму используют посевы микроорганизмов не старше 24-часового возраста.

Г.2.2 Для приготовления мазков суспензию микроорганизмов бактериологической петлей наносят на обезжиренное предметное стекло, распределяют тонким слоем на площади около 1 , высушивают на воздухе и фиксируют. Для фиксации предметное стекло захватывают пинцетом и три раза проводят над верхней частью некоптящего пламени мазком вверх. На остывший мазок через полоску фильтровальной бумага наносят красящий раствор.

Г.2.3 Для выявления глобул в бациллярных клетках мазки окрашивают раствором фуксина, приготовленным по ГОСТ 10444.1. Клетки бацилл группы B.cereus, выращенные на агаре с глюкозой, заполнены неокрашенными глобулами на фоне окрашенной протоплазмы.

Г.2.4 Для окраски по Граму в модификации Хукера мазки окрашивают раствором кристаллического фиолетового с щавелевокислым аммонием. Через 0,5-1,0 мин с окрашенного мазка удаляют бумагу и избыток красителей, мазок промывают проточной водой, наносят на него йодный раствор по Бурке. Спустя 0,5-1,0 мин мазок промывают 96%-ным этиловым спиртом, погружая его последовательно в несколько порций спирта до тех пор, пока с мазка не будут стекать окрашенные струйки. Затем с мазка удаляют остатки спирта, промывая его водой. Промытый мазок окрашивают красителем контрастного цвета, выдерживая 2-3 мин в растворе сафранина, затем промывают водой и высушивают. Грамположительные микроорганизмы образуют с основным красителем стойкое соединение, то есть окрашиваются в сине-фиолетовый цвет основного красителя. Грамотрицательные микроорганизмы теряют основной краситель и приобретают красный цвет контрастного красителя. Допускается окрашивать мазок 1%-ным водным раствором кристаллического фиолетового, метилового фиолетового или генцианвиолета и после закрепления краски йодным раствором по Бурке промывать препарат ацетоном и докрашивать 0,5%-ным водным раствором сафранина или спиртовым раствором фуксина. Растворы для окрашивания препаратов готовят по ГОСТ 10444.1.

При микроскопировании споры, которые не окрашиваются фуксином или по Граму, хорошо видны на фоне окрашенной протоплазмы.

Г.2.5 Для обнаружения бактериальных спор в мазках при микроскопировании с фазовоконтрастным устройством приготавливают препарат на голодном агаре. Горячий раствор голодного агара наносят пипеткой на чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло, которое для получения на нем тонкой, равномерной пленки агара быстро поворачивают на ребро, давая стечь избытку раствора. На застывшую пленку голодного агара бактериологической петлей наносят каплю культуральной жидкости, накрывают ее покровным стеклом выпуклой стороной вверх и слегка прижимают его к поверхности предметного стекла. При микроскопировании бактериальные непроросшие споры выглядят как отдельно расположенные или внутриклеточные блестящие, хорошо преломляющие свет образования, проросшие споры выглядят тусклыми или темными образованиями.

Г.2.6 Для окраски спор на мазок наносят раствор малахитовой зелени, приготовленный по ГОСТ 10444.1, и нагревают его в течение 1 мин до появления паров жидкости, после охлаждения промывают водой, затем докрашивают в течение 30 с раствором сафранина или фуксина, вновь промывают водой и микроскопируют. Бактериальные споры окрашиваются в зеленый, вегетативные клетки - в красный цвет.

Г.2.7 Мазки, приготовленные по Г.2.3 - Г.2.6, микроскопируют с использованием масляной иммерсии при увеличении .

Г.3 Определение присутствия в посевах анаэробных микроорганизмов

Присутствие в посевах анаэробных микроорганизмов определяют путем высева одной-двух капель культуральной жидкости и (или) ее разведений одним из способов, указанных ниже.

Г.3.1 Культуральную жидкость и (или) ее разведения переносят в чашки Петри (отдельные для культуральной жидкости и каждого ее разведения). Посевы в чашках Петри заливают агаризованной питательной средой для аэробных, факультативно-анаэробных или анаэробных микроорганизмов, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Посевной материал и среду тщательно перемешивают. Чашки помещают в анаэростат или герметичную камеру, удаляют из них кислород, создавая анаэробные условия культивирования. Рост микроорганизмов контролируют через 24-48 ч. Анаэробные микроорганизмы образуют в анаэробных условиях колонии, характерные для роста в использованной питательной среде.

Г.3.2 На застывшую поверхность питательной среды посевов, проведенных аналогично указаниям Г.3.1 и с учетом того, что слой посевного материала с питательной средой в чашках Петри должен быть не менее 0,8 см, пинцетом помещают стерильное предметное стекло так, чтобы под стеклом не было пузырьков воздуха. Чашки Петри в перевернутом виде термостатируют не в анаэробных условиях при температуре °С. Рост микроорганизмов контролируют через 24-48 ч. Анаэробные микроорганизмы растут наиболее обильно под центральной частью предметного стекла (на расстоянии от края 1-3 мм) сплошной массой или в виде отдельных колоний, образуя пузырьки газа и (или) разрывы питательной среды.

Г.3.3 Посевы культуральной жидкости и (или) ее разведений в чашках Петри заливают средой Вильсон-Блера или другой агаризованной средой, содержащей реактивы для определения сульфитредуцирующей способности. Посевной материал и среду тщательно перемешивают. Посевы термостатируют в анаэробных условиях по Г.3.1 (или на застывшую поверхность питательной среды помещают предметное стекло по Г.3.2) при температуре °С не более 72 ч. Сульфитредуцирующие микроорганизмы образуют на среде с сульфитами черные, коричневые колонии или колонии, вызывающие потемнение среды.

Г.3.4 Культуральную жидкость и (или) ее разведения переносят в стерильные пробирки (отдельную для культуральной жидкости и каждого ее разведения). Посевы в пробирках заливают агаризованной питательной средой так, чтобы образовался столбик высотой 10-11 см. Стерильной пипеткой перемешивают содержимое засеянных пробирок так, чтобы в среде не оставалось пузырьков воздуха.

Культуральную жидкость и (или) ее разведения, перенесенные в стерильные пробирки, можно высевать в трубки Вейона. Для этого в стерильную трубку Вейона набирают агаризованную питательную среду температурой 50-60°С и переносят в пробирку с культуральной жидкостью или ее разведением. Той же трубкой Вейона тщательно перемешивают содержимое пробирки и засасывают это содержимое в трубку Вейона так, чтобы не оставалось пузырьков воздуха в трубке Вейона (за исключением острого конца и поверхности среды). Острый конец трубки Вейона запаивают в пламени горелки. Засеянные трубки Вейона оставляют в вертикальном положении для застывания среды.

Посевы в пробирках или трубках Вейона термостатируют не в анаэробных условиях при температуре °С. Рост микроорганизмов контролируют через 24-48 ч.

Анаэробные микроорганизмы растут в высоких столбиках среды на некотором расстоянии от поверхности среды. Это расстояние зависит от окислительно-восстановительного потенциала питательной среды, необходимого для роста микроорганизмов.

Г.3.5 При определении присутствия в посевах термофильных микроорганизмов посевы по Г.3.1 - Г.3.4 термостатируют при температуре 55-62°С.

Г.4 Определение способности выделенных микроорганизмов к спорообразованию в анаэробных условиях

Пересевы культуральной жидкости из первичных посевов делают на жидкие (вязкие) или агаризованные питательные среды. Посев на жидкие (вязкие) среды проводят с учетом требований 7.7.2 стандарта, а на агаризованные - Г.3. При выборе сред учитывают, что некоторые сахаролитические виды клостридии не образуют спор при отсутствии ферментируемых сахаров, но для спорообразования большинства других видов среда не должна содержать ферментируемые сахара. Лучшими средами для спорообразования являются среды, приготовленные на основе мясного бульона с кусочками мяса или сердца. При сомнении в наличии спор их образование стимулируют прогревом вторичных посевов в течение 10 мин при температуре °С для термоустойчивых клостридии и 10 мин при температуре °С для нетермоустойчивых клостридии. Посевы для наблюдения за спорообразованием термостатируют не более 48 ч при температуре °С и затем выдерживают не более 3 сут при 20-25°С. При необходимости, в процессе термостатирования или выдержки из посевов приготавливают по Г.2 мазки для обнаружения спор.