Приложение Г (обязательное). Определение микотоксинов (по биотесту с инфузориями)

Приложение Г
(обязательное)

Определение микотоксинов (по биотесту с инфузориями)

Метод предназначен для определения микотоксинов в растительных маслах в условиях заводских лабораторий и при проведении научных исследований.

Метод основан на реакции инфузорий тетрахимена пирифермис на наличие в экстракте из масла токсинов, синтезируемых мицеллиальными грибами при их развитии на используемом сырье.

Г.1 Отбор проб - по ГОСТ 5471.

Г.2 Аппаратура, реактивы, материалы

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 1000 г.

Микроскопы с 7 - 8-кратным увеличением марок МБР-1, МБИ-1, МБИ-11, МБИ-15 и другие с аналогичными характеристиками.

рН-метры лабораторные (иономеры) с пределом измерений 0-14 единиц рН и ценой деления шкалы 0,05 единиц рН, снабженные стеклянными или хлорсеребряными электродами.

Воронка делительная ВД-1 - 500 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы плоскодонные II-1-250-29/32 ТХС, П-2-250-34 ТХС, П-1-500-29/32 ТХС, П-2-500-34 ТХС, П-1-1000-45/40 ТХС или колбы конические Кн-1-250-24/29 ТХС, Кн-2-250-34 ТХС, Кн-1-500-29/32 ТХС, Кн-1-500-34/35 ТХС, Кн-1-500-45/40 ТХС, Кн-2-500-34 ТХС, Кн-2-500-40 ТХС, Кн-2-500-50 ТХС, Кн 1-1000-45/40 ТХС, Кн-2-1000-42 ТХС по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1-2-50, 1-3-50, 1-4-50 и 1-2-250, 1-3-250, 1-4-250 по ГОСТ 1770.

Чашки Петри (биологические) БН-1-100 по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 1-1-1-1, 1-1-1-2 по ГОСТ 29228.

Пробирки П1-14-120 ХС, П1-16-150 ХС, ПI2-14-100 ХС, П2-16-150 ХС, П2-16-180 ХС по ГОСТ 25336.

Стекло часовое.

Палочки стеклянные с оплавленными концами длиной 10 - 15 см, диаметром 0,3 - 0,5 см.

Автоклав.

Спиртовка.

Спирт этиловый технический по ГОСТ 17299 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300, раствор с массовой долей 30%.

Эфир петролейный по нормативному документу [10].

Эфир медицинский [11].

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Пептон по ГОСТ 13805.

Дрожжевой экстракт.

Глюкоза по ГОСТ 6038.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Культуру инфузорий тетрахимена пириформис.

Г.3 Подготовка к испытанию

Г.3.1 Получение водно-спиртовых экстрактов из масла

В колбе вместимостью 250 взвешивают около 50 г масла, записывают результат с точностью до второго десятичною знака, добавляют 125 петролейною эфира, перемешивают и раствор сливают в делительную воронку. Затем в колбу приливают 50 раствора этилового спирта и проводят экстракцию встряхиванием. После разделения слоев водно-спиртовой экстракт сливают в колбу вместимостью 250 , к раствору масла в делительной воронке вновь добавляют 50 раствора этилового спирта и экстракцию повторяют. Операцию экстракции проводят пять раз. Экстракты объединяют и определяют объем. Соотношение (навеска : раствор этилового спирта) должно составлять 1:5.

Г.3.2 Приготовление пептонной среды

Пептонную среду для выращивания инфузорий (рН 7.1) готовят по следующей рецептуре:

пептон	-	2,0 г;
дрожжевой экстракт	-	0,1 г;
глюкоза	-	0,1 г;
хлористый натрий	-	0,1 г;
дистиллированная вода	-	100 .

Стерилизацию воды и среды проводят в течение 20 мин при давлении 0,06 мПа (0,6 атм.) в автоклаве.

Г.3.3 Поддержание жизнедеятельности культуры инфузорий тетрахимена пириформис

Для поддержания жизнедеятельности культуры инфузорий ежемесячно пересевают на свежую пептонную среду. Пересев осуществляют в стерильных условиях.

В стеклянную пробирку, края которой стерилизуют непосредственно перед посевом в пламени спиртовки, приливают 4 пептонной среды, приготовленной, как указано в 3.2, и вносят 0,2 культуры инфузорий стерильной пипеткой. Пипетку предварительно обжигают в пламени спиртовки, не допуская ее нагрева, так как инфузории очень чувствительны к температуре и гибнут при температуре выше 28°С.

Пробирку закрывают стерильной пробкой над пламенем спиртовки и хранят при температуре (202)°С в темноте.

Г.4 Проведение испытания

На часовое стекло пипеткой наносят 0,04 приготовленного водно-спиртового экстракта масла и после полного испарения водно-спиртового раствора на то же место наносят 0,04 стерильной воды. Оставшиеся на часовом стекле после испарения водного раствора спирта вещества тщательно растирают с водой оплавленным концом стеклянной палочки, в полученную среду вносят 0,02 культуры инфузорий. Количество особей должно составлять около в 1 .

Часовое стекло с инфузориями помещают на предметный столик микроскопа и ведут наблюдения при 7 - 8-кратном увеличении микроскопа в течение суток, отмечая поведение инфузорий через 3 и 20 мин, через 2 и 24 ч.

В промежутках между наблюдениями часовое стекло с инфузориями помещают в чашку Петри с фильтровальной бумагой, смоченной водой, и хранят при температуре (202)°С.

При наблюдении отмечают появление различных дегенеративных форм (особей с несколькими выпячиваниями протоплазмы, возникновение кеглеобразных и шарообразных клеток и вытекание протоплазмы) и изменение характера движения.

Г.5 Обработка результатов

При наличии микотоксинов инфузории вначале начинают двигаться зигзагообразно, затем по кругу, постепенно их движение замедляется, затем они останавливаются, изменяется форма клетки и наступает ее распад.

Отсутствие микотоксинов в пробе устанавливают по сохранению жизнедеятельности всех инфузорий через 24 ч.

Для сравнения проводят контрольную пробу: на часовое стекло наносят 0,04 водного раствора этилового спирта. После его испарения наносят капельку воды с культурой инфузорий. Дальнейшее определение ведут по Г.4.