Приложение А. Состав и приготовление питательных сред и растворов реактивов

Приложение А
(обязательное)

Состав и приготовление питательных сред и растворов реактивов

А.1 Вода пептонная забуференная

А.1.1 Состав

Пептон, г	10,0
Натрий хлористый (NaCI), г	5,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (), г	9,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный (), г	1,5
Вода,	1000

А.1.2 Приготовление

При нагревании растворяют компоненты в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,00,2) при температуре 25°С. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости с учетом добавления необходимой массы (объема) пробы пищевого продукта (если масса равна 25 г, то разливают по 225 , то есть в соотношении 1:10). Стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

А.2 Среда обогатительная селективная: бульон для бактерий рода Shigella

А.2.1 Основа среды

Гидролизат казеина ферементативный, г	20,0
Натрий хлористый, г	5,0
Калий фосфорнокислый двузамещенный, г	2,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный, г	2,0
Глюкоза, г	1,0
Твин-80, г	1,5
Вода,	1000

При нагревании и частом помешивании растворяют в 1 воды дегидратированные компоненты или 31,5 г дегидратированной основы.

Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,00,2) при температуре 25°С. Разливают среду во флаконы. Стерилизуют при температуре (1211)°С в течение 15 мин, охлаждают до 45-50°С и с соблюдением правил асептики добавляют на 1 среды 5 раствора селективной добавки, приготовленной по А.2.2. Тщательно перемешивают и мерно разливают в стерильную посуду (флаконы или колбы, или пробирки). Готовая среда должна быть прозрачной и иметь светло-янтарную окраску.

А.2.2 Добавка селективная

А.2.2.1 Состав

Новобиоцин, мг	55
Вода,	5

А.2.2.2 Приготовление

С соблюдением правил асептики растворяют новобиоцин в стерильной воде, тщательно перемешивают. Антибиотик новобиоцин подавляет рост грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий.

А.3 Среды агаризованные селективно-диагностические

А.3.1 Первая среда: агар ксилоза лизин дезоксихолатный (XLD агар)

А.3.1.1 Основа среды

А.3.1.1.1 Состав

Экстракт дрожжевой (порошок), г	3,0
Натрий хлористый, г	5,0
Ксилоза, г	3,5
Лактоза, г	7,5
Сахароза, г	7,5
L-лизин гидрохлорид, г	5,0
Тиосульфат натрия, г	6,8
Железо III аммоний цитрат, г	0,8
Феноловый красный, г (или 20 раствора, приготовленного по А.3.1.2, если среду готовят из отдельных компонентов)
	0,08
Натрий дезоксихолат, г	2,5
Агар, г (зависит от желирующих свойств)	9,0-18,0
Вода,	1000

А.3.1.1.2 Приготовление

При нагревании и частом помешивании растворяют дегидратированые компоненты основы или дегидратированную основу в воде.

Доводят до кипения, но не кипятят, избегая перегрева. Устанавливают рН так, чтобы после прогрева он составлял (7,40,2) при температуре 25°С. Разливают основу во флаконы подходящей вместимости. Затем прогревают на кипящей водяной бане около 5 мин.

А.3.1.2 Раствор фенолового красного

А.3.1.2.1 Состав

Феноловый красный, г	0,4
Вода,	100

А.3.1.2.2 Приготовление

Феноловый красный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре.

А.3.1.3 Приготовление чашек Петри с агаром

После прогрева среду помещают в водяную баню при температуре 44 - 47°С, затем перемешивают и разливают приблизительно по 15 в стерильные чашки Петри. Дают затвердеть.

Чашки со средой хранят в холодильнике при температуре (32)°С не более 5 сут.

Перед использованием подсушивают (приблизительно 30 мин) поверхность агара в чашках Петри (предпочтительней с открытой крышкой и поверхностью агара вниз) в шкафу или термостате с температурой 37 - 55°С до тех пор, пока поверхность агара не станет сухой.

А.3.2 Вторая среда:

А.3.2.1 Среда Плоскирева.

А.3.2.2 Среда Эндо.

А.3.2.3 Среда Левина.

А.3.2.4 Агар сальмонелла-шигелла.

А.3.2.5 Агар дезоксихолатный цитратный.

А.3.2.6 Агар висмут-сульфитный.

Среды готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.4 Агар питательный или ГРМ-агар

А.4.1 Состав

Экстракт мясной, г	3,0
Пептон, г	5,0
Агар, г (зависит от желирующих свойств)	9,0 - 18,0
Вода,	1000

А.4.2 Приготовление

При нагревании растворяют компоненты в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,40,2) при температуре 25°С. Переносят питательную среду в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин. Среду в пробирках при необходимости скашивают.

А.4.3 Приготовление чашек Петри с питательным агаром

После стерилизации или расплавления среду помещают в водяную баню при температуре 44-47°С, затем разливают приблизительно по 15 в стерильные чашки Петри. Дают затвердеть. Используют среду без подсушивания.

Допускается использование ГРМ-агара (питательный агар для культивирования микроорганизмов на основе гидролизата рыбной муки), который готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.5 Агар мясо-пептонный - по ГОСТ 10444.1

А.6 Бульон мясо-пептонный с глюкозой - по ГОСТ 10444.1

Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 .

А.7 Среды с углеводами (среды Гисса)

Среды готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, среду из которых готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.8 Агар трехсахарный железистый (TSI агар), или агар Клиглера, или агар Олькеницкого

А.8.1 Состав TSI агара

Экстракт мясной, г	3,0
Экстракт дрожжевой, г	3,0
Пептон, г	20,0
Натрий хлористый, г	5,0
Лактоза, г	10,0
Сахароза, г	10,0
Глюкоза, г	1,0
Железа III цитрат, г	0,3
Натрия тиосульфат, г	0,3
Феноловый красный, г (или 6 раствора, приготовленного по А.3.1.2, если среду готовят из отдельных компонентов)
	0,024
Агар, г (зависит от желирующих свойств)	9,0-18,0
Вода,	1000

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 + 0,2) при температуре 25°С. Переносят по 7-8 среды в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин. После стерилизации оставляют в наклонном положении так, чтобы получился столбик среды высотой, равной приблизительно двум диаметрам пробирки (2-2,5 см), а над ним - скошенная поверхность длиной около 5 см.

Допускается использование агара Клиглера или среды Олькеницкого. Среды готовят в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке.

А.9 Агар с мочевиной (агар Кристенсена)

А.9.1 Основа среды

А.9.1.1 Состав

Пептон, г	1,0
Глюкоза, г	1,0
Натрий хлористый, г	5,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный, г	2,0
Феноловый красный, г (или 3 раствора, приготовленного по А.3.1.2, если среду готовят из отдельных компонентов)
	0,012
Агар, г (зависит от желирующих свойств)	9,0-18,0
Вода,	1000

А.9.1.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (6,80,2) при температуре 25°С. Основу среды равномерно разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

А.9.2 Раствор мочевины

А.9.2.1 Состав

Мочевина, г	40,0
Вода, , не более	100

А.9.2.2 Приготовление

Мочевину помещают в колбу вместимостью 100 , растворяют в воде, объем раствора доводят водой до метки. Раствор мочевины стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670 через фильтры с размером диаметра пор 0,22 мкм, или текучим паром в течение 30 мин.

А.9.3 Раствор фенолового красного

А.9.3.1 Состав и приготовление - по А.3.1.2

А.9.4 Среда готовая

А.9.4.1 Состав

Основа (А.9.1),	950
Раствор мочевины (А.9.2),	50

А.9.4.2 Приготовление

Прибавляют с соблюдением правил асептики раствор мочевины к основе, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры 44-47°С. Разливают готовую среду в стерильные пробирки по 7-8 . После этого среду скашивают так, чтобы получились скошенная поверхность и столбик среды высотой, равной приблизительно двум диаметрам пробирки - 2-2,5 см (А.9.2).

А.10 Среда для определения L-лизин декарбоксилазы

А.10.1 Состав

L-лизин моногидрохлорид, г	5,0
Экстракт дрожжевой, г	3,0
Глюкоза, г	1,0
Бромкрезоловый пурпуровый, г (или 5 раствора, приготовленного по А.10.3)	0,015
Вода,	1000

А.10.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (6,80,2) при температуре 25°С. Разливают среду по 2-5 в стерильные пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

А.10.3 Раствор бромкрезолового пурпурного

А.10.3.1 Состав

Бромкрезоловый пурпурный, г	0,3
Вода,	100

А.10.3.2 Приготовление

Бромкрезоловый пурпурный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят водой до метки.

Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

А.11 Среда для Фогес-Проскауера (VP) реакции

А.11.1 Состав

Пептон, г	7,0
Глюкоза, г	5,0
Калий двузамещенный фосфорнокислый, г	5,0
Вода,	1000

А.11.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (6,90,2) при температуре 25°С. По 3 среды разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

А.12 Реактив для Фогес-Проскауера (VP) реакции

А.12.1 Раствор креатина (N-амидиносаркозин)

А.12.1.1 Состав

Креатина моногидрат, г	0,5
Вода,	100

А.12.1.2 Приготовление

Растворяют креатина моногидрат в воде.

А.12.2 1-нафтол, спиртовой раствор

А.12.2.1 Состав

1-нафтол, г	6
Этиловый спирт 96%-ный (по объему),	100

А.12.2.2 Приготовление

Растворяют 1-нафтол в 96%-ном этиловом спирте.

А.12.3 Калия гидроксида раствор

А.12.3.1 Состав

Калия гидроксид (КОН), г	40
Вода,	100

А.12.3.2 Приготовление

Растворяют калия гидроксид в воде в мерной колбе вместимостью 100 , раствор доводят водой до метки.

А.13 Среда Козера

А.13.1 Состав

Натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный, г	1,5
Калий фосфорнокислый однозамещенный, г	1,0
Магний сернокислый, г	0,2
Цитрат натрия, г	3,0
Вода,	1000

А.13.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,20,1) при температуре 25°С. Разливают среду мерно во флаконы подходящей вместимости. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

После стерилизации к 1 среды добавляют 10 спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по А.13.3. Затем по 6-7 среды разливают в стерильные пробирки. Приготовленная среда должна иметь оливково-зеленый цвет.

А.13.3 Бромтимолового синего раствор

А.13.3.1 Состав

Бромтимоловый синий, г	0,5
Вода,	100

А.13.3.2 Приготовление

Бромтимоловый синий переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

А.14 Среда Симмонса

Для приготовления среды Симмонса к 1 среды Козера (А.13) перед стерилизацией добавляют 18-20 г агара. Среду после стерилизации и добавления раствора бромтимолового синего разливают по 6-7 в стерильные пробирки или по 15 в чашки Петри. Среду в пробирках скашивают.

А.15 Агар дезоксихолатный цитратный

А.15.1 Состав 1 и состав 2 - в соответствии с таблицей А.1

Таблица А.1

Наименование компонента	Состав 1	Состав 2
Настой сердца (порошок), г	10,0	-
Протеозопептон, г	10,0	-
Перевар животной ткани пептический, г	-	10,0
Экстракт мясной, г	-	10,0
Лактоза, г	10,0	10,0
Цитрат натрия, г	20,0	20,0
Аммоний железо III цитрат, г	2,0	-
Железа III цитрата тригидрат, г	-	1,0
Натрия дезоксихолат, г	5,0	5,0
Нейтральный красный, г	0,02	0,02
Агар, г	13,5	13,5
Вода,	1000	1000

А.15.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу (состав 1 или состав 2) в воде. Устанавливают рН так, чтобы после нагревания для состава 1 при температуре 25°С рН составлял (7,50,2) и для состава 2 при температуре 25°С рН составлял (7,30,2). Среду не автоклавируют. После охлаждения до температуры 44°С- 47°С среду разливают приблизительно по 15 в стерильные чашки Петри.

А.16 Энтероагар гектоеновый

А.16.1 Состав

Протеозопептон, г	12,0
Экстракт дрожжевой, г	3,0
Желчь, г	9,0
Лактоза, г	12,0
Сахароза, г	12,0
Салицин, г	2,0
Натрий хлористый, г	5,0
Натрия тиосульфат, г	5,0
Железо III аммонийное цитрат, г	1,5
Бромтимоловый синий, г	0,065
Фуксин (кислый), г	0,1
Агар, г	15,0

А.16.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в 1 воды, кипятят в течение 1 мин, охлаждают до температуры 44°С-47°С и разливают приблизительно по 15 в стерильные чашки Петри.

А.17 Полужидкий питательный агар

А.17.1 Состав

Экстракт мясной, г	3,0
Пептон, г	5,0
Агар, г (зависит от желирующих свойств)	4,0-9,0
Вода,	1000

А.17.2 Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты или дегидратированную основу в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,00,2) при температуре 25°С.

Перед стерилизацией среду разливают по 7-8 в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

А.18 Полужидкий мясо-пептонный агар

Готовят по ГОСТ 10444.1 так же, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0-9,0 г агара на 1 мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией по 7-8 среды разливают в пробирки.

А.19 Физиологический раствор

А.19.1 Состав

Натрий хлористый, г	8,5
Вода,	1000

А.19.2 Приготовление

Растворяют хлористый натрий в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,00,2) при температуре 25°С. Стерилизуют в автоклаве при температуре (1211)°С в течение 15 мин.

Готовые питательные среды хранят в соответствии с требованиями ГОСТ 10444.1.

Допускается использование готовых и дегидратированных, в т.ч. хромогенных, питательных сред аналогичного состава, разрешенных к применению в установленном порядке.