8. Проведение испытания - в соответствии с приложением Б (рисунок Б.1)

8 Проведение испытания - в соответствии с приложением Б (рисунок Б.1).

8.1 Проба для анализа и исходное разведение

8.1.1 Общие положения

Для приготовления исходного разведения в основном используют как разбавитель неселективную среду, указанную в 5.2.1 и 4.2 (забуференную пептонную воду).

Если масса (объем) пробы для анализа другая, чем 25 г, то используют необходимый объем неселективной среды исходя из соотношения массы (объема) анализируемого продукта и объема неселективной среды 1:10.

Допускается объединение проб для анализа в том случае, если анализируется больше одной пробы от продукта и когда объединенная проба не влияет на результат испытания. (Например, необходимо проанализировать 10 проб по 25 г. Объединяют 10 проб продукта (общая масса составит 250 г) и прибавляют 2,25 неселективной среды).

8.1.2 Специфика приготовления исходного разведения для некоторых продуктов

Указанную специфику приготовления применяют только для выявления бактерий рода Shigella.

8.1.2.1 Какао и какаосодержащие продукты (какао больше, чем 20%)

Добавляют в забуференную пептонную воду (по 5.2.1) 100 г обезжиренного молочного порошка или 50 г казеина (кислый казеин не используют). Казеин и молочный порошок добавляют при приготовлении забуференной пептонной воды до стерилизации.

8.1.2.2 Высококислотные пищевые продукты

При неселективном обогащении должна быть гарантия того, что рН посевов будет не менее 5,0.

рН высококислотных пищевых продуктов стабилизируют путем использования забуференной пептонной воды двойной концентрации.

Допускается при высеве жидких высококислотных пищевых продуктов, для предотвращения снижения рН сред на 0,5 и более, рН продукта перед посевом доводить до (7,00,2).

При высеве твердых высококислотных пищевых продуктов допускается доводить рН до (7,00,2) в посевах.

Доведение рН продукта проводят с соблюдением правил асептики с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемых растворов устанавливают опытным путем.

8.2 Неселективное обогащение

Посев в забуференную пептонную воду по 8.1.1 инкубируют при температуре (371)°С в течение (182) ч.

8.3 Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 8.2, пересевают в среду для селективного обогащения. Для этого по 1 культуральной жидкости пересевают в 10 бульона для бактерий рода Shigella.

Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

Если от одного пищевого продукта проведен высев нескольких проб продукта для анализа (каждой пробы отдельно) для выявления бактерий рода Shigella, то допускается из каждого посева по 8.2 проводить пересев в один флакон с бульоном для шигелл. При этом количество селективной среды во флаконе должно быть увеличено по сравнению с 10 во столько раз, из скольких посевов проводят пересев.

Свежие продукты, не содержащие сублетально поврежденных микроорганизмов, подвергнутых каким-либо воздействиям, например сушке, заморозке и т.д., допускается высевать непосредственно в селективную среду, минуя этап неселективного обогащения. Объемы высеваемого продукта и среды должны быть в соотношении не менее 1:10.

8.4 Выделение чистой культуры

8.4.1 Культуры после 24 ч инкубирования на селективной среде пересевают так, чтобы получить хорошо изолированные колонии на ксилоза лизин дезоксихолатный агар (XLD агар) и на одну из агаризованных сред: гектоеновый энтероагар, сальмонелла-шигелла агар, висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или дезоксихолатный цитратный агар.

При отсутствии чашек большого размера по 6.14 используют для пересева петлей две чашки нормального размера по 6.14 (одну за другой). Пересев проводят в соответствии с требованиями приложения В.

На ксилозализин дезоксихолатном агаре проводят учет ферментации лактозы, сахарозы, ксилозы, декарбоксилирование лизина, образование сероводорода.

Бактерии рода Shigella не ферментируют лактозу, сахарозу, ксилозу, не декарбоксилируют лизин и не образуют сероводород.

На гектоеновом энтероагаре проводят учет ферментации лактозы, сахарозы, салицина и образование сероводорода.

Бактерии рода Shigella не ферментируют салицин.

На сальмонелла-шигелла агаре проводят учет ферментации лактозы и образование сероводорода.

На дезоксихолатном цитратном агаре, среде Плоскирева, среде Эндо, среде Левина проводят учет ферментации лактозы.

На висмут-сульфитном агаре проводят учет ферментации глюкозы и обнаружение сульфитредуцирующих свойств.

Бактерии рода Shigella не обладают сульфитредуцирующими свойствами.

8.4.2 Посевы на чашках Петри по 8.4.1 переворачивают на крышку дном вверх и помещают в термостат при температуре (371)°С и инкубируют в течение (242) ч.

8.4.3 После инкубации просматривают чашки с посевами и отмечают присутствие типичных для бактерий рода Shigella колоний и атипичных колоний, которые могут быть отнесены к бактериям рода Shigella. Отмечают их местоположение на дне чашек.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на XLD агаре, имеют красный цвет, который принадлежит цвету индикатора.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на гектоеновом энтероагаре, имеют зеленый или голубоватый цвет.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на дезоксихолатном цитратном агаре, на сальмонелла-шигелла агаре, на средах Эндо, Плоскирева, Левина, круглые бесцветные или слегка розоватые.

Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на висмут-сульфитном агаре, имеют серо-зеленый цвет.

При отсутствии в посевах на селективно-диагностических средах типичных для бактерий рода Shigella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Shigella в анализируемой пробе продукта.

При наличии хотя бы на одной селективно-диагностической среде типичных колоний проводят подтверждение принадлежности их к бактериям рода Shigella.

8.5 Подтверждение принадлежности выделенных бактерий к роду Shigella

8.5.1 Общие положения

Для определения биохимических характеристик выделенных бактерий допускается использование идентификационных наборов. Эти наборы используют в соответствии с инструкцией.

Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, разрешенных к применению в установленном порядке.

8.5.2 Отбор колоний для подтверждения

Для подтверждения берут с посева в чашку Петри по 8.4.1 (две чашки нормального размера считают за одну) каждой селективной среды (8.4) сначала одну типичную колонию и затем четыре колонии, если первая окажется отрицательной.

Для идентификации в случае эпидемиологической ситуации одновременно отбирают пять колоний. Если на одной чашке меньше пяти типичных колоний, то отбирают все типичные колонии.

Переносят отобранные колонии на скошенную поверхность питательного или ГРМ-агара в чашках или пробирках (5.2.4) или мясо-пептонного агара (5.2.5), для идентификации отбирают полностью изолированные колонии. Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

Для биохимической и серологической идентификации используют чистые культуры бактерий.

Из отобранных для биохимической идентификации колоний приготовляют мазки и окрашивают по Граму по ГОСТ 30425.

Бактерии рода Shigella являются грамотрицательными прямыми палочками.

Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегорсена. Для этого на предметном стекле в капле 3%-ного водного раствора калия гидроокиси эмульгируют культуру микроорганизмов, взятую из колонии с агаризованной среды. Если через несколько секунд взвесь ослизнет и за петлей потянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность анализируемой культуры к грамотрицательному виду бактерий. У грамположительных бактерий слизистых нитей не образуется.

8.5.3 Биохимическое подтверждение

У отобранных и предварительно пересеянных культур изучают характер роста на TSI агаре, или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого возможность расщепления мочевины, образования ацетоина, утилизации цитрата, наличие L-лизин декарбоксилазы и подвижность.

8.5.3.1 Общие положения

Петлей инокулируют специфические среды с 8.5.3.2 по 8.5.3.7 каждой культурой, полученной из колоний по 8.5.2.

8.5.3.2 TSI агар (5.2.8), среда Олькеницкого или агар Клиглера

Засевают штрихом скошенную поверхность агара и уколом - столбик. Инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

Интерпретация изменений в среде

а) Столбик

- желтый	глюкозу ферментирует (реакция положительная)
- красный или неизменившийся	глюкозу не ферментирует (реакция отрицательная)
- черный	образование сероводорода
- пузырьки или разрывы	образование газа при ферментации глюкозы

б) Скошенная поверхность

- желтая	лактозу и (или) сахарозу ферментирует (реакция положительная)
- красная или неизменившаяся	лактозу и сахарозу не ферментирует (реакция отрицательная) Агар Клиглера содержит два сахара (глюкозу и лактозу), поэтому по скошенной поверхности учитывают ферментацию только лактозы

Типичные культуры бактерий рода Shigella показывают щелочную (красную) скошенную поверхность и кислый (желтый) столбик без образования газа (пузырьков), сероводород (черный агар) не образуется.

Отношение выделенных культур к бактериям рода Shigella не может основываться только на результатах теста на TSI агаре или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого.

Дальнейшему испытанию подвергаются бактерии, показавшие типичные характеристики на TSI агаре или на агаре Клиглера, или среде Олькеницкого.

При снятии результатов роста выявленных бактерий на трехсахарном агаре (агаре Клиглера, среде Олькеницкого) учитывают типичный рост для бактерий рода Salmonella, руководствуясь требованиями ГОСТ 52814. Если подобный рост бактерий обнаружен, то дальнейшее испытание проводят с учетом возможного присутствия бактерий рода Salmonella.

8.5.3.3 Агар с мочевиной (агар Кристенсена) (5.2.9)

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной. Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч, наблюдая за посевами через определенные промежутки времени.

При положительной реакции, расщеплении мочевины с выделением аммония, цвет фенолового красного изменяется от розового до сильного светло-вишневого.

Для уреазоположительных бактерий реакция в основном становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Shigella мочевину не расщепляют.

8.5.3.4 Определение L-лизин декарбоксилазы (5.2.10)

Инокулируют снизу жидкую среду для определения L-лизин декарбоксилазы (5.2.10). Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

Помутнение и пурпуровый цвет после инкубации указывают на положительную реакцию. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

Бактерии рода Shigella не обладают L-лизин декарбоксилазой (реакция отрицательная).

8.5.3.5 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) (5.2.11)

Анализируемую культуру суспензируют петлей в стерильной пробирке, содержащей 3 VP среды (5.2.11) или мясо-пептонного бульона с глюкозой (5.2.6).

Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

После инкубации к посеву прибавляют две капли раствора креатина, три капли спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, содержимое пробирки перемешивают после прибавления каждого реактива.

Образование от розового до светло-красного цвета после 15 мин указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Shigella не образуют ацетоин (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).

Допускается определение ацетоина проводить без применения раствора креатина. Для этого после инкубирования к 1 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 раствора 1-нафтола и 0,2 раствора гидроокиси калия, содержимое пробирки перемешивают после прибавления каждого реактива.

Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию.

8.5.3.6 Определение подвижности

Культуры пересевают уколом в полужидкий питательный агар (5.2.17) или полужидкий мясо-пептонный агар (5.2.18).

Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение (242) ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузионный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.

Бактерии рода Shigella неподвижны.

8.5.3.7 Определение утилизации цитрата

Культуру высевают в пробирки со средой Козера (5.2.13) или на поверхность среды Симмонса (5.2.14). Посевы инкубируют при температуре (371)°С в течение 24-48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый (или синий) указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Shigella не утилизируют цитрат.

8.5.3.7 Интерпретация биохимических тестов приведена в таблице Г.1 приложения Г.

8.5.4 Серологическое подтверждение

8.5.4.1 Общие положения

Определение присутствия антигенов у изучаемых культур (8.5.2) проводят путем постановки реакции агглютинации на предметном стекле с соответствующими сыворотками после исключения самоагглютинирующих штаммов. Сыворотки используют в соответствии с инструкцией изготовителя, если есть отличие от описания, приведенного ниже.

Серологическое подтверждение принадлежности к бактериям рода Shigella проводят с культурами, предварительно пересеянными на поверхность питательного агара, мясо-пептонного агара или ГРМ-агара.

8.5.4.2 Исключение самоагглютинирующих штаммов

Помещают каплю физиологического раствора на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Допускается размешивание части колонии в капле воды и перемешивании этого раствора с одной каплей физиологического раствора.

Стекло осторожно покачивают в течение 30-60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемая культура бактерий обладает самоагглютинацией.

Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшему серологическому испытанию.

8.5.4.3 Определение наличия антигенов

Культуры бактерий, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными шигеллезными сыворотками.

Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в инструкциях, прилагаемых к сывороткам.

Агглютинация (наличие О-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.

Используют поливалентные сыворотки, одну после другой.

8.5.5 Интерпретация биохимических и серологических тестов

Интерпретация подтверждающих тестов (8.5.3 и 8.5.4) для испытанных культур бактерий (8.5.2) представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Интерпретация подтверждающих тестов

Биохимические реакции	Самоагглютинация	Серологические реакции	Интерпретация
Типичные	Нет	Антигены обнаружены	Штамм относится к бактериям рода Shigella
Типичные	Нет	Антигены не обнаружены	Могут быть отнесены к бактериями рода Shigella
Типичные	Да	Не тестируется (см. 8.5.4.2)
Нетипичные реакции	Нет/Да	Антигены обнаружены
Нетипичные реакции	Нет/Да	Антигены не обнаружены	Не могут быть отнесены к бактериям рода Shigella

При определении биохимических и серологических тестов выделенных культур в качестве контроля используют типичные по этим показателям штаммы бактерий рода Shigella, указанные в разделе 6.

Культуры, предположительно отнесенные к бактериям рода Shigella, передают в компетентные аккредитованные центры по изучению этих бактерий для окончательного их типирования. Культуру при этом сопровождают всей полученной информацией с указанием наименования продукта, из которого выделен штамм.

В этом случае результаты выявления бактерий рода Shigella выдают после получения ответа по окончательному их типированию.