Приложение 2. Метод определения 5-аминолевуленовой кислоты в моче

Приложение 2
к МР 1.2.0054-11

Метод определения 5-аминолевуленовой кислоты в моче

Принцип метода: при воздействии ионов свинца в организме нарушается процесс превращения 5-аминолевуленовой кислоты (АЛК) в её метаболит - порфобилиноген (ПБГ). В результате этого, в зависимости от степени интоксикации, возрастает экскреция АЛК с мочой, а экскреция ПБГ, соответственно, снижается.

П1. Основное и вспомогательное оборудование

П1.1. Центрифуга с охлаждением 3-18К, производства "Sigma", Германия или другая с аналогичными параметрами.

П1.2. Спектрофотометр видимого света на длину волны 555 нм СФ-46 (Россия) или другой с аналогичными параметрами, прошедший метрологическую поверку в установленном порядке.

П1.3. Кюветы кварцевые или стеклянные для спектрофотометрии с длиной хода луча 1 см.

П1.4. Водяная баня с электрическим подогревом на температуру до +95°С.

П1.5. Бытовой холодильник по ГОСТ 26678-85 с морозильной камерой на температуру до -18°С.

П1.6. Дозаторы жидкости автоматические с одноразовыми наконечниками, емкостью 20-200 , 100-1000 и 1000-5000 , обеспечивающие суммарную погрешность дозирования на уровне %, производства "Eppendorf Research", Германия или другие с аналогичными параметрами.

П1.7. Пробирки центрифужные полиэтиленовые или полипропиленовые, объём 10 .

П1.8. Пробирки стеклянные на объём 10-20 по ГОСТ 25336-82.

П1.9. Пробирки стеклянные на объём 10 со шлифом N 14 и пробками по ГОСТ 25336-82.

П1.10. Цилиндры мерные на 50 и 100 по ГОСТ 1770-74;

П1.11. Одноразовые полиэтиленовые наконечники для лабораторных дозаторов объемом 10-200 , 100-1000 и 1000-5000 , производства "Eppendorf", Германия или другие с аналогичными параметрами.

П1.12. Штатив для пробирок

П1.13. Дистиллятор электрический ДЭ-4-2, производства ОАО "Тюменский завод медицинского оборудования и инструментов", Россия или другой с аналогичными параметрами.

П2. Материалы и реактивы

П2.1. Набор для определения 5-аминолевуленовой кислоты (АЛК) и порфобилиногена (ПБГ) хроматографическим-спектрофотометрическим методом (5-aminolevulenic acid (ALA)/porphobilinogen (PBG) chromatographic-spectrophotometric), производства "Biosystems S.A" (Испания) или аналогичный.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

П2.1. Хлорная кислота 52% х.ч. или импортный аналог квалификации "Analytical grade".

П3. Приготовление рабочих растворов (в соответствии с инструкцией к набору)

П3.1. Раствор "В": переносят раствор "В2" во флакон с реагентом "В1" и перемешивают до полного растворения. Раствор хранят в холодильнике при +2-4°С в темноте.

П3.2. Стандартный раствор АЛК: к содержимое флакона "S" растворяют в 5 дистиллированной воды. Раствор хранят в морозильной камере при -18°С.

П3.3. Реактив Эрлиха: 1,14 хлорной кислоты смешивают с 6 раствора "В". Готовить непосредственно перед использованием.

П4. Проведение анализа (в соответствии с инструкцией к набору)

П4.1. У колонок "АЛА" и "ПГБ" отламывают пластмассовые кончики-заглушки, опускают фильтры на поверхность геля стеклянной палочкой, дают стечь жидкости и промывают 10 дистиллированной воды.

П4.2. Образцы мочи размораживают и центрифугируют 20 минут при скорости 3000 об/мин в центрифуге с охлаждением.

П4.3. Колонку "ПГБ" помешают над колонкой "АЛА". Через колонки последовательно пропускают 1 мочи и 20 деионизованной воды; элюат отбрасывают.

П4.4. Колонку "АЛА" помещают в пробирку на 10 со шлифом, установленную в штативе. Пропускают через колонку 10 раствора "1". Элюат собирают в пробирку и перемешивают.

П4.5. К собранному элюату добавляют 0,2 реагента "А" (ацетилацетон). Аналогично тот же объём реагента "А" добавляют к 10 раствора "1" (бланк) и к смеси 0,2 стандартного раствора АЛК с 9,8 раствора "1". Все образцы тщательно перемешивают и помещают на кипящую водяную баню на 10 мин.

П4.6. После охлаждения образцов из них отбирают по 1 в стеклянные пробирки, добавляют 1 "реактива Эрлиха", выдерживают 5 мин и фотометрируют при длине волны 555 нм против "бланка".

Концентрацию АЛК в моче рассчитывают по формуле:

,

где [ALK] - концентрация АЛК в единицах ; - оптическая плотность пробы, - оптическая плотность стандартного образца.

П4.7. Через колонки ПБГ пропускают по 4 раствора "2". Элюат собирают и перемешивают. Отбирают 1 элюата, смешивают с 1 "реактива Эрлиха", выдерживают 5 мин и фотометрируют при длине волны 555 нм против "бланка", содержащего вместо элюата дистиллированную воду.

Концентрацию ПБГ в моче рассчитывают по формуле:

,

где - оптическая плотность пробы.