Методические указания МУК 4.2.1069-01 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149 - продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 сентября 2001 г.)

Методические указания
МУК 4.2.1069-01
"Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149 - продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 сентября 2001 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium funiculosum F-149 - продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149 и его гигиенический норматив

Систематическое положение микроорганизма

Класс	Fungi imperfecti
Порядок	Hyphomycetales
Семейство	Mucedinaceae
Род	Penicillium
Секция	Biverticillata
Вид	funiculosum
Штамм	F-149

Округлые колонии имеют 4-5 мм в диаметре, в зависимости от плотности посева могут достигать 11 мм в диаметре. Поверхность колоний слабо шероховатая, пушистая, консистенция мягкая. Воздушный мицелий имеет белоснежно-белую окраску. На 3-4 день развития желтовато-кремовый субстрат меняет свою окраску, становясь ярко-оранжевым. Продолжительность развития гриба составляет 26 - 30 дней. Репродуктивными органами гриба являются конидиеносцы с конидиями (споры), может также размножаться вегетативно (фрагментами мицелия).

Штамм Penicillium funiculosum F-149 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГНИИгенетики. Штамм является продуцентом декстраназы. Активность по методу Нельсона составляет 10-12 ед/мл культуральной жидкости. Изучаемый штамм выделен из почвы, аэроб, растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 28-30°С, оптимальный рН 6-8. Наиболее интенсивный рост наблюдается на агаризованном пивном сусле 7°Б, для выращивания могут также использоваться картофельно-сахарозный агар, агаризованная среда Чапека, среда Чапека-Докса.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 , пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам и ярко-оранжевому окрашиванию субстрата на 3-4 сутки. Вопрос о корреляции между пигментной и ферментативной активностью плесневого гриба требует дополнительных исследований.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)	ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х 10	ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл	ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74
Секундомер	ГОСТ 9586-75
Барометр	ГОСТ 24696-79
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики группы аминогликозидов: канамицин, неомицин и др.
Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67
Агаризованное пивное сусло 7°Б для штамма-продуцента (агар - 1,8%, рН 6,8, режим стерилизации 1,1-1,2 атм в течение 30 мин)

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения "Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 5)°С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерений

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды - пивное агаризованное сусло 7°Б. Время аспирации воздуха (1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3-4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованное пивное сусло 7°Б расплавляют, остужают до 50-60°С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин и др.) из расчета 20-30 мг на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28-30°С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 воздуха производят по формуле:

, , где

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 . Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки, содержащиеся в 1,57 л воздуха. Количество клеток в 1 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 (время аспирации, мин).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N 

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента

Penicillium funiculosum F-149 в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа ________________________________

Место отбора пробы ____________________________________

Название лаборатории __________________________________

Юридический адрес организации __________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или N пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация,

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с).

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с).

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко