Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья "Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная" (АКДС-вакцина)

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья
"Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная"
(АКДС-вакцина)

Вводится впервые

Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная (АКДС-вакцина) представляет собой смесь инактивированных коклюшных клеток и обезвреженных формальдегидом и теплом дифтерийного и столбнячного токсинов, очищенных и адсорбированных на алюминия гидроксиде или другом, разрешенном к применению, минеральном сорбенте.

В состав лекарственного средства входит консервант.

Производство

Столбнячный анатоксин.

При производстве столбнячного анатоксина используют штаммы/штамм Clostridium tetani, полученные и депонированные в официальной Государственной коллекции. Микробные клетки культивируют на жидких питательных средах, обеспечивающих высокую продукцию столбнячного токсина. Методы культивирования должны гарантировать сохранение свойств штаммов и предотвращать их контаминацию. Токсинсодержащую культуральную жидкость, освобожденную от микробных клеток и продуктов их распада, проверяют на стерильность, рН и содержание токсина. Для производства столбнячного анатоксина используют культуральную среду с активностью токсина не менее 40 ЕС/Lf в 1 мл. Детоксикация столбнячного токсина должна обеспечивать сохранение антигенной активности анатоксина и гарантировать его безопасность: отсутствие остаточной токсичности (специфическая безопасность) и реверсии токсических свойств. Столбнячный анатоксин должен быть очищен от примесей, вызывающих побочные реакции при введении человеку.

Определение специфической безопасности столбнячного анатоксина.

5 морским свинкам массой тела  г вводят подкожно 1500 Lf (суммарно в бок и внутреннюю поверхность верхней трети бедра) столбнячного анатоксина. В течение 21 сут наблюдения у животных не должно наблюдаться признаков столбняка (ригидность лапки, искривление позвоночника, или сочетание указанных признаков). Если более одного животного гибнут по причине, не связанной со специфической интоксикацией, испытание повторяют. Если при повторном испытании гибнут более одного животного столбнячный анатоксин испытание не проходит.

Реверсия токсичности столбнячного анатоксина

Готовят раствор, содержащий столбнячный анатоксин, консервант и другие компоненты (за исключением алюминия гидроксида) в концентрации, принятой для готовой вакцинной массы. Полученную смесь делят на две части и выдерживают в течение 42 сут: первую - при температуре °С, вторую - при температуре от 2 до 8°С. Каждый образец водят подкожно 4 морским свинкам в объеме 5 мл. Наличие признаков столбняка в течение 21 сут наблюдения за животными свидетельствует о присутствии в пробе столбнячного токсина.

Для производства АКДС-вакцины можно использовать только стерильный и безопасный столбнячный анатоксин с антигенной чистотой не менее 1000 ЕС (или Lf) на мг белкового азота.

Дифтерийный анатоксин.

При производстве дифтерийного анатоксина используют токсигенный штамм Corynebacterium diphtheriae, полученный и депонированный в официальной Государственной коллекции. Микробные клетки культивируют на жидких питательных средах, обеспечивающих высокую продукцию дифтерийного токсина. Методы культивирования должны гарантировать сохранение свойств штамма и предотвращать его контаминацию. Токсинсодержащую культуральную жидкость, освобожденную от микробных клеток и продуктов их распада, проверяют на стерильность, рН и содержание токсина. Для производства дифтерийного анатоксина используют культуральную среду с активностью токсина не менее 80 Lf в 1 мл. Детоксикация дифтерийного токсина должна обеспечивать сохранение антигенной активности анатоксина и гарантировать его безопасность: отсутствие остаточной токсичности (специфическая безопасность) и реверсии токсических свойств. Для характеристики очищенного дифтерийного анатоксина определяют его рН, специфическую (антигенную) активность, содержание общего и белкового азота, антигенную чистоту (удельную активность). Дифтерийный анатоксин должен быть очищен от примесей, вызывающих побочные реакции при введении человеку.

Определение специфической безопасности дифтерийного анатоксина.

5 морским свинкам массой тела  г вводят подкожно 1500 Lf (суммарно в оба бока) дифтерийного анатоксина. В течение 42 сут наблюдения у животных не должно наблюдаться изъязвлений, инфильтратов, абсцессов, некрозов на местах инъекции и потери массы тела. Если наблюдается гибель хотя бы одного животного от дифтерийной интоксикации (красные надпочечники при аутопсии погибших животных) дифтерийный анатоксин применению не подлежит. Если более одного животного гибнут по причине, не связанной с дифтерийной интоксикацией, испытание повторяют. Если при повторном испытании гибнут более одного животного дифтерийный анатоксин испытание не проходит.

Реверсия токсичности дифтерийного анатоксина.

Готовят раствор, содержащий дифтерийный анатоксин, консервант и другие компоненты (за исключением алюминия гидроксида) в концентрации, принятой для готовой вакцинной массы. Полученную смесь делят на две части и выдерживают в течение 42 сут: первую - при температуре 35-37°С, вторую - при температуре от 2 до 8°С. По 0,1 мл каждого раствора вводят внутрикожно 2 морским свинкам массой тела
 г. Наличие реакций на месте инъекции в течение 4 сут наблюдения свидетельствует о присутствии во введенном растворе дифтерийного токсина (реверсии токсичности).

Для производства АКДС-вакцины можно использовать только стерильный и безопасный дифтерийный анатоксин, содержащий не менее 1500 Lf на мг белкового азота.

Инактивированная коклюшная суспензия.

Инактивированная коклюшная суспензия (КС) представляет собой стерильную взвесь обезвреженных формальдегидом цельных микробных клеток Bordetella pertussis. Для производства коклюшной суспензии используют штаммы, полученные и депонированные в официальной коллекции. Производство коклюшной суспензии должно быть основано на системе посевных серий. Культуры рабочих посевных серий должны обладать теми же характеристиками, что и культуры штамма, из которого была получена исходная посевная серия.

Взвесь микробных клеток должна содержать агглютиногены 1, 2 и 3. При производстве коклюшной суспензии (КС) используют штаммы Bordetella pertussis (серотип 1.2.3 - 1 штамм, серотип 1.2.0. - 1 штамм, серотип 1.0.3. - 1 штамм), взятые в равных соотношениях. Содержание формальдегида в инактивированной КС не более 400 мкг/мл, мертиолята - от 80 до 120 мкг/мл.

Уровень агглютиногенов 1, 2 и 3 следует определять на стадии получения объединенной КС и перед добавлением адъюванта или объединением с другими компонентами комбинированных вакцин. Для определения уровня содержания агглютиногенов используют Сыворотки диагностические коклюшные к агглютиногенам 1, 2, 3 и паракоклюшные к агглютиногену 14, адсорбированные, для реакции агглютинации (РА), сухие. Содержание агглютиногенов 1, 2, 3 определяют по величине титра сыворотки. Титром считают величину, соответствующую последнему разведению сыворотки, дающему агглютинацию на три креста. КС должна агглютинироваться соответствующими адсорбированными сыворотками к агглютиногенам в титре не ниже 1:1280. Уровень агглютиногенов должен поддерживаться на постоянном уровне, присущем уровню исходного штамма.

Реакция агглютинации с сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 коклюшного микроба

Для проведения реакции используют сыворотки диагностические коклюшные к агглютиногенам 1, 2, 3 адсорбированные для реакции агглютинации (РА), сухие.

В ампулы с сухими адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 добавляют 1,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида рН для получения разведения 1:10 (или другой объем в соответствии с указанием в паспорте на сыворотку). Содержимое ампул перемешивают до однородного состояния.

Для постановки развернутой РА готовят двукратные разведения сывороток от 1:10 до 1:5120 на 0,9% растворе натрия хлорида рН .

В ряд пробирок, за исключением первой, наливают по 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида рН . Затем в первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки в разведении 1:10. После тщательного перемешивания содержимого второй пробирки 0,5 мл полученного разведения 1:20 из второй пробирки переносят в третью, где получают разведение 1:40, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки ряда, содержащей предельное разведение сыворотки, 0,5 мл жидкости удаляют для сохранения общего объема.

В ряд агглютинационных пробирок с двукратными разведениями сывороток в объеме 0,5 мл вносят равный объем микробной взвеси с концентрацией клеток 10 МОЕ (за 1 МОЕ условно принят 1 млрд коклюшных микробных клеток в 1 мл). Одновременно проводят контроль сыворотки и антигена в тех же объемах на отсутствие спонтанной агглютинации:

- сыворотка в разведении 1:10 с 0,9% раствором натрия хлорида рН ;

- микробная взвесь в 0,9% растворе натрия хлорида рН .

Содержимое пробирок перемешивают путем встряхивания штатива. Затем штатив помещают на 2 ч в термостат при температуре °С, после чего оставляют на 18-20 ч при температуре °С.

Результаты реакции агглютинации учитывают визуально до встряхивания пробирок, а затем для более точного учета - в агглютиноскопе при осторожном встряхивании осадка путем медленного наклона пробирки.

Учет реакции:

"++++" - полная агглютинация: большой плотный осадок, четко сформирован "зонтик", полное просветление надосадочной жидкости; после легкого встряхивания - крупные хлопья в прозрачной надосадочной жидкости;

"+++" - осадок большой, рыхлый, надосадочная жидкость еще прозрачна, слегка опалесцирует; после легкого встряхивания - средние хлопья в слегка опалесцирующей надосадочной жидкости;

"++" - мелкие, нестойкие хлопья, осадок небольшой, рыхлый, надосадочная жидкость непрозрачна; после легкого встряхивания - мелкие, нестойкие хлопья;

"+" - следы агглютинации: в центре небольшой осадок, надосадочная жидкость непрозрачная;

"-" - отрицательная реакция: осадка нет или небольшой компактный осадок в центре дна пробирки, взвесь равномерно мутная.

Инактивированная КС должна обладать специфической безопасностью.

Полноту инактивации коклюшных микробов (специфическую безопасность) определяют в опытах на животных.

Испытуемую КС вводят внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл, содержащем 10 млрд коклюшных бактерий (прививочная доза вакцины для человека) 10 мышам белым беспородным массой тела г. 10 мышам контрольной группы внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида рН , содержащего ту же концентрацию того же консерванта, который присутствует в вакцине. Для испытания используют здоровых животных одного пола и из одной партии. Если используют животных обоего пола, их следует равномерно распределить по группам. Непосредственно перед введением вакцины определяют общую массу каждой группы мышей. Через 72 ч и повторно спустя 7 сут после введения определяют общую массу каждой группы мышей. Вакцина считается безопасной, если:

а) через 72 ч общая масса тела опытных животных не ниже их исходной массы тела перед введением препаратов;

б) через 7 сут относительный прирост массы тела мышей, получивших испытуемую вакцину, составляет не менее 60% прироста массы тела контрольных животных.

В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши или потери в массе тела по сравнению с первоначальной, опыт повторяют на удвоенном количестве мышей с теми же требованиями. В случае гибели при повторном контроле хотя бы одной мыши препарат непригоден.

Коклюшная суспензия не должна содержать биологически активного термолабильного (дермонекротического) токсина.

Определение проводят на кроликах или мышах-сосунках. Коклюшная суспензия в концентрации 4 МОЕ (международная оптическая единица) в объеме 0,2 мл при внутрикожном введении кролику не должна вызывать развития инфильтратов и образования некрозов; допускается гиперемия не более 10 мм в диаметре. В качестве контроля используют введение живой культуры в концентрации 1 МОЕ в объеме 0,2 мл, которая вызывает некроз размером не менее 5 мм в диаметре. Определение проводят на двух белокожих кроликах массой 1,5-2,0 кг. Учет результатов проводят ежедневно в течение 4 сут.

КС, содержащая 1 МОЕ в объеме 0,05 мл, при подкожном введении в затылочную область трем-четырехдневным мышам-сосункам не должна вызывать изменения кожных покровов. В качестве положительного контроля используют живую коклюшную культуру, взятую в той же концентрации и объеме, в качестве отрицательного контроля - 0,9% раствор натрия хлорида. Каждый препарат вводят двум животных. Учет реакции проводят ежедневно в течение 5 сут. В случае появления сине-пурпурного окрашивания области шеи реакцию считают положительной.

Для обоих тестов в качестве положительного контроля используют живую двухсуточную культуру тест-штамма или производственного (не подвергнутого инактивации) штамма, выращенную на среде Борде-Жангу с 30% крови человека или КУА с 10% крови человека.

Для производства вакцины используют КС с концентрацией клеток от 50 до 80 МОЕ в 1 мл, рН 6,8-7,4.

Испытания

Описание. Мутная жидкость белого или белого с сероватым или желтоватым оттенком цвета. При отстаивании разделяется на рыхлый осадок белого или белого с сероватым или желтоватым оттенком цвета, легко диспергируемой при встряхивании, и прозрачную надосадочную жидкость. Испытания проводят визуально в проходящем свете.

Подлинность. Должна обладать специфической (иммуногенной) активностью, обеспечивая защиту от действия дифтерийного и столбнячного токсинов и коклюшных микробов. Определение проводят методом летального заражения, изложенным в разделе "Специфическая активность". В частных фармакопейных статьях могут быть указаны альтернативные методы, подтверждающие наличие в лекарственном средстве дифтерийного и столбнячного анатоксинов, обладающих антигенной активностью.

Подлинность микробных клеток Bordetella pertussis определяют в реакции агглютинации с соответствующей антисывороткой после выделения бактериальной массы вакцины.

Механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 6,8 до 7,4, если в частной фармакопейной статье нет иных указаний. Испытания проводят потенциометрическим методом с не разведенной АКДС-вакциной в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Стерильность. Должна быть стерильной. Испытания проводят методами прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность".

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксичной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Белым мышам массой тела 14 - 16 г препарат вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл, морским свинкам массой тела 250-350 г - подкожно по 3,0 мл (по 1,5 мл в оба бока). За животными наблюдают 7 суток. В течение указанного времени не должно наблюдаться гибели животных и потери массы тела.

Специфическая безопасность. Должна быть безопасной (дифтерийный и столбнячный компоненты) при подкожном введении 5 морским свинкам массой  г шести прививочных доз для человека (суммарно в бок и лапку). Через 30 дней все животные должны остаться живыми без симптомов столбняка и потери массы тела.

Специфическую безопасность коклюшного компонента оценивают аналогично методу, описанному для определения специфической безопасности коклюшной суспензии.

Специфическая (иммуногенная) активность. Специфическая активность 1 мл вакцины должна быть не менее 8 международных единиц (МЕ) для коклюшного, 60 МЕ для дифтерийного и 120 МЕ для столбнячного компонентов. Определение специфической активности каждого компонента вакцины проводят методом летального заражения в соответствии с ОФС "Иммуногенность адсорбированного дифтерийного анатоксина" для дифтерийного компонента, ОФС "Иммуногенность адсорбированного столбнячного анатоксина" для столбнячного компонента, ОФС "Иммуногенность цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин" для инактивированных коклюшных клеток.

Специфическую активность дифтерийного и столбнячного компонентов возможно оценивать по титру соответствующих антител в сыворотке крови иммунизированных животных в тестах с параллельным использованием стандартных образцов, калиброванных в МЕ.

Полнота сорбции. В 1 мл надосадочной жидкости содержание неадсорбированного дифтерийного анатоксина не должно превышать 1 Lf, неадсорбированного столбнячного анатоксина - 0,1 ЕС/Lf, если в частной фармакопейной статье нет иных указаний. Полноту сорбции определяют путем индикации неадсорбированных дифтерийного и столбнячного анатоксинов в надосадочной жидкости АКДС-вакцины. Определение содержания неадсорбированного дифтерийного анатоксина в надосадочной жидкости проводят в соответствии с ОФС "Определение концентрации анатоксинов/токсинов в реакции флокуляции", неадсорбированного столбнячного анатоксина - в соответствии с ОФС "Определение концентрации анатоксинов в реакции антитоксинсвязывания". Допустимое количество неадсорбированного антигена указывают в частных фармакопейных статьях.

Формальдегид. Не более 100 мкг/мл. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение формальдегида".

Производственные штаммы микроорганизмов. Раздел должен содержать следующую информацию: наименование штаммов; место их депонирования; допустимое количество пассажей (при необходимости) и методику их проведения с указанием условий культивирования; при необходимости дополнительные к паспортным данным требования к характеристикам штаммов.

Консерванты. Тиомерсал (мертиолят). Определение проводят колориметрическим или атомно-абсорбционным методом в соответствии с ОФС "Определение тиомерсала". Концентрация антимикробных консервантов не должна быть ниже минимально эффективной и не превышать, указанную на этикетке более чем на 15% .

Сорбенты. Алюминия гидроксид. Не более 1,25 мг/мл алюминия , если в частной статье нет иных указаний. Определение проводят комплексонометрическим методом в соответствии с ОФС "Комплексонометрическое титрование. Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических препаратах".

Извлекаемый объем. Не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства. На первичную упаковку наносят дополнительное указание "Встряхивать!". На вторичную упаковку наносят дополнительные указания "Перед употреблением встряхивать", "Замораживание не допускается".

Транспортирование и хранение. Транспортирование и хранение при температуре от 2 до 8 °С.