Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42 "Эритропоэтин раствор концентрированный"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42
"Эритропоэтин раствор концентрированный"

Вводится впервые

Аминокислотная последовательность

/---------\

|

|    APPRLICDSR VLERYLLEAK EAENITTGCA

|                              |

|        /---------------------/

|

|    EHCSLNENIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA

|

|    VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVNSSQPWEP

|

|    LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS

|

|    PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

|

|    GKLKLYTGEA CRTGD

|

\---------------/

Молекулярная масса от 30000 до 38000 Da

Эритропоэтин раствор концентрированный представляет собой раствор, содержащий семейство близкородственных гликопротеинов, которые по аминокислотной последовательности (165 аминокислот) и усредненному профилю гликозилирования гомологичны эндогенному эритропоэтину, продуцируемому клетками почек человека.

Белок эритропоэтина специфически стимулирует эритропоэз, активирует митоз и созревание эритроцитов из клеток-предшественников эритроцитарного ряда.

Раствор содержит 0,5-10 мг/мл эритропоэтина, а также соли и другие вспомогательные вещества. Активность раствора составляет не менее 100 000 МЕ/мг белка активного вещества, определение проводится в соответствии с условиями, описанными в разделах "Специфическая активность" и "Белок".

Эритропоэтин в качестве активного вещества входит в состав инъекционных иммунобиологических лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения анемии различного генеза.

Производство

Производство эритропоэтина проводится при условии стабильности на всех этапах производства и неукоснительном соблюдении правил GMP.

Эритропоэтин продуцируется клетками млекопитающих методом in vitro, основанном на использовании технологии рекомбинантной ДНК.

Перед выпуском каждую партию готового нефасованного продукта (балк) тестируют по показателям, указанным ниже, если не сделаны исключения уполномоченным органом.

Примесь белков клеток-продуцентов: не более 0,1% на 1 мг белка в соответствии с требованиями ОФС "Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК", если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Примесь ДНК клеток-продуцентов и ДНК вектора: не более 10 нг на дозу в соответствии с требованиями ОФС "Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК", если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Испытания

Описание. Бесцветный прозрачный или слегка опалесцирующий раствор.

Подлинность

А. Биологический метод in vivo по показателю "Специфическая активность"

Испытуемый раствор должен стимулировать продукцию ретикулоцитов у нормоцитемических мышей при проведении испытания согласно условиям, описанным в разделе "Специфическая активность".

В. Капиллярный электрофорез Содержание изоформ на электрофореграмме испытуемого раствора должно находиться в следующих пределах:

Изоформы	Содержание (%)
1	Не более 15
2	Не более 15
3	1 - 20
4	10 - 35
5	15 - 40
6	10 - 35
7	5 - 25
8	Не более 15

Определение проводят в соответствии с ОФС "Капиллярный электрофорез".

Методика определения

Условия проведения электрофореза: В приборе для электрофореза устанавливают напряжение 143 В/см и выдерживают в течение 80 мин (15,4 кВ для капилляров с общей длиной 107 см), используя в качестве электролита буферный раствор для капиллярного электрофореза (КЭ).

Детектирование: спектрофотометрия при длине волны 214 нм

Устанавливают автосамплер на температуру 4°С для хранения образцов во время анализа.

Введение: под давлением или в условиях вакуума.

Пригодность хроматографической системы: на электрофореграмме стандартного раствора должно наблюдаться характерное расположение хорошо разделившихся пиков, соответствующее пикам на электрофореграмме эритропоэтина, прилагаемой к стандартному образцу фармакопейного качества эритропоэтина BRP. Самый большой пик должен быть не менее чем в 50 раз больше уровня ("шума") базовой линии. При необходимости регулируют нагрузку образца для получения пиков достаточной высоты. Идентифицируют пики по изоформам 1 - 8. Должен присутствовать пик изоформы 8, и разрешение между пиками изоформы 5 и изоформы 6 должно быть не менее 1. Испытания проводят не менее 3 раз. Базовая линия должна быть стабильной, с незначительным дрейфом; качественное и количественное распределение пиков должно соответствовать распределению пиков на электрофореграмме, прилагаемой к стандартному образцу эритропоэтина BRP. Относительное стандартное отклонение времени миграции пика изоформы 2 должно быть менее 2%.

Результаты: идентифицируют пики изоформ 1 - 8 на электрофореграмме испытуемого раствора путем сравнения с электрофореграммой стандартного раствора. Рассчитывают содержание (в процентах) каждой изоформы, исходя из площади соответствующего пика. Расчет проводится при помощи программы, встроенной в прибор.

Примечания

Испытуемый раствор. Приготовление испытуемого раствора 1 мг/мл указывают в частной фармакопейной статье. 0,25 мл полученного раствора обессоливают, пропуская его через картридж-микроконцентратор, содержащий мембраны с пределом отсечения по молекулярной массе не более 10 000 Да, прибавляют 0,2 мл воды и снова обессоливают. Процедуру обессоливания повторяют не менее трех раз. Далее образец разводят водой, как указано в частной фармакопейной статье и определяют концентрацию белка, как описано в разделе "Белок". Доводят концентрацию белка приблизительно до 1 мг/мл водой. Раствор готовят перед использованием, хранению не подлежит.

Стандартный раствор. Содержимое флакона стандартного образца эритропоэтина BRP растворяют в 0,25 мл воды. Проводят обессоливание раствора, как описано для испытуемого раствора. Раствор готовят перед использованием, хранению не подлежит.

Капилляр:

- материал: кварцевое стекло без покрытия

- размер: эффективная длина около 100 см, диаметр 50 мкм

Температура: 35°С

Концентрат буферного раствора для КЭ. В состав раствора входит 0,1 М раствор натрия хлорида, 0,1 М раствор трицина, 0,1 М раствор натрия ацетата. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,584 г натрия хлорида, 1,792 г трицина и 0,820 г безводного натрия ацетата, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают.

1 М раствор путресцина: В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,882 г путресцина растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают. Раствор по 0,5 мл помещают в пластиковые пробирки вместимостью 1,5 мл. Условия хранения и срок годности должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

Буферный раствор для КЭ. В состав раствора входит 0,01 М раствор трицина, 0,01 М раствор натрия хлорида, 0,01 М раствор натрия ацетата, 7 М раствор мочевины, 2,5 мМ раствор путресцина.

В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 21,0 г мочевины растворяют в 25 мл воды, нагревая на водяной бане при 30°С, прибавляют 5,0 мл концентрата буферного раствора для КЭ, 125 мкл 1 М раствора путресцина перемешивают и доводят объем раствора до метки тем же растворителем и вновь перемешивают. При температуре 30°С доводят рН раствора до 5,55 разведенной кислотой уксусной и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Условия хранения и срок годности должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

Предварительная подготовка капилляра: капилляр промывают в течение 60 мин 0,1 М раствором натрия гидроксида, профильтрованным через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и в течение 60 мин. - буферным раствором для КЭ. Поддерживают напряжение тока 20 кВ в течение 12 ч.

Промывание капилляра перед определением: капилляр промывают в течение 10 мин водой очищенной, в течение 5 мин - 0,1 М раствором натрия гидроксида, профильтрованным через мембранный фильтр 0,45 мкм и в течение 10 мин - буферным раствором для КЭ.

С. Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг.

На электрофореграмме испытуемого раствора (а) должна быть видна одиночная широкая полоса, соответствующая по положению и интенсивности одиночной широкой полосе на электрофореграмме стандартного раствора (а).

Электрофорез в полиакриламидном геле проводят в соответствии с ОФС "Электрофорез" и ОФС "Определение чистоты и подлинности белковых препаратов методом Вестерн-блот".

Методика определения

Объем и порядок нанесения испытуемых образцов: На определение отбирают по 20 мкл испытуемых образцов и наносят на гель в следующем порядке: стандартный раствор (с), стандартный раствор (а), испытуемый раствор (а), пустая ячейка, стандартный раствор (b), испытуемый раствор (b), стандартный раствор (d).

По окончании электрофореза из прибора вынимают кассету с гелем и разрезают гель на 2 части: в первой части должны быть стандартный раствор (с), стандартный раствор (а), испытуемый раствор (а); во второй - стандартный раствор (b), испытуемый раствор (b), стандартный раствор (d).

Детектирование: первую часть геля окрашивают окрашивающим раствором, как указано в частной фармакопейной статье

Пригодность системы: критерии пригодности системы устанавливают при валидации методики с использованием стандартного раствора (с).

Примечания

Размеры геля: толщина 0,75 мм, площадь около 16 .

Разрешающий гель: 12% акриламида.

Испытуемый раствор (а). Испытуемый препарат разводят водой очищенной до получения концентрации 1,0 мг/мл, приготовление должно быть описано в частной фармакопейной статье. К одной объемной части испытуемого раствора (1 мг/мл) прибавляют одну объемную часть буферного раствора, используемого для приготовления образцов при проведении электрофореза как указано в частной фармакопейной статье.

Испытуемый раствор (b). Испытуемый препарат разводят водой очищенной до получения концентрации 0,1 мг/мл, приготовление должно быть описано в частной фармакопейной статье. К одной объемной части этого раствора прибавляют одну объемную часть буферного раствора для приготовления образцов при проведении электрофореза как указано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (а). Содержимое флакона стандартного образца эритропоэтина BRP растворяют в 0,25 мл воды очищенной. К одной объемной части этого раствора прибавляют одну объемную часть буферного раствора для приготовления образцов при проведении электрофореза как указано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (b). Содержимое флакона стандартного образца эритропоэтина BRP растворяют в воде очищенной и доводят тем же растворителем до получения концентрации 0,1 мг/мл. К одной объемной части этого раствора прибавляют одну объемную часть буферного раствора для приготовления образцов при проведении электрофореза как указано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (с). Раствор маркеров молекулярных масс (в диапазоне 10-70 кДа), пригодный для калибровки полиакриламидных гелей с натрия додецилсульфатом.

Стандартный раствор (d). Раствор предварительно окрашенных маркеров молекулярных масс (в диапазоне 10-70 кДа), пригодный для калибровки полиакриламидных гелей с натрия додецилсульфатом и для электроблоттинга на соответствующую мембрану.

Обработка пробы: инкубация в течение 2-х мин при температуре 95 - 100°С.

(b) Иммуноблоттинг проводят в соответствии с ОФС "Определение чистоты и подлинности белковых препаратов методом Вестерн-блот".

На электрофореграмме испытуемого раствора (b) должна быть видна одиночная (основная) широкая полоса, соответствующая по расположению и интенсивности одиночной (основной) полосе на электрофореграмме стандартного раствора (b).

Особенности методики определения

Вторую часть геля переносят на мембрану, пригодную для иммобилизации белков, используя оборудование для электроблоттинга. После окончания электроблоттинга мембрану выдерживают в нейтральном изотоничном буферном растворе, содержащем соответствующий блокирующий агент (например, 50 г/л сухого молока или 10% по объему (об/об) эмбриональной телячьей сыворотки), в течение 1-2 ч, состав которого указывают в частной фармакопейной статье. Затем мембрану инкубируют в течение 1-14 ч в том же блокирующем растворе с соответствующим разведением, указанном в частной фармакопейной статье, поликлональных или моноклональных антител к эритропоэтину.

Антитела, связавшиеся с эритропоэтином, выявляют, используя вторичные антитела, меченные ферментами или радиоактивной меткой (например, антитела, коньюгированные с щелочной фосфатазой).

Характеристика блокирующих агентов, концентрация и время инкубации должны быть указаны в частных фармакопейных статьях.

Пригодность системы: на электрофореграмме стандартного раствора (d) маркеры молекулярных масс должны быть разделены на дискретные полосы с линейной зависимостью между пройденным расстоянием и десятичным логарифмом молекулярных масс.

D. Пептидное картирование

Профиль хроматограммы испытуемого раствора должен соответствовать профилю хроматограммы стандартного раствора. Испытание проводят методом жидкостной хроматографии в соответствии с ОФС "Общие принципы анализа цитокинов и интерферонов методом обращеннофазной ВЭЖХ".

Особенности методики определения

Уравновешивание: уравновешивают хроматографическую колонку в течение минимум 15 мин подвижной фазой А. Проводят анализ холостого раствора, используя градиентную программу (см. Примечание).

Введение: 50 мкл

Пригодность хроматографической системы: хроматограммы испытуемого раствора и стандартного раствора качественно должны совпадать с хроматограммой гидролизата эритропоэтина, прилагаемой к стандартному образцу эритропоэтина BRP.

Примечания

Испытуемый раствор.

Испытуемый образец разбавляют трис-ацетатным буферным раствором рН 8,5 до концентрации общего белка 1,0 мг/мл. Проводят диализ против трис-ацетатного буфера рН 8,5 (условия проведения диализа указывают в частной фармакопейной статье) или используют методику мембранной фильтрации, описанную в испытании В при определении подлинности, с заменой обессоленного образца трис-ацетатным буферным раствором рН 8,5. Диализованный раствор переносят в полипропиленовую центрифужную пробирку. Готовят свежий раствор трипсина для пептидного картирования с концентрацией 1 мг/мл в воде очищенной, прибавляют 5 мкл указанного раствора к 0,25 мл диализованного раствора. Пробирку закрывают и помещают в водяной термостат при температуре 37°С на 18 час. Образец извлекают из водяной бани и немедленно останавливают реакцию путем замораживания образца до -20°С.

Трис-ацетатный буферный раствор рН 8,5:

0,294 г кальция хлорида и 12,11 г трис-(гидроксиметил)аминометана помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, добавляют 700 мл воды очищенной, перемешивают, доводят рН раствора до 8,5 с помощью концентрированной кислоты уксусной, доводят объем раствора до метки водой очищенной.

Стандартный раствор. Содержимое флакона стандартного образца эритропоэтина BRP растворяют в 0,25 мл воды очищенной. Раствор готовят аналогично и при тех же условиях, что и испытуемый раствор.

Хроматографические условия

Колонка: длина 0,25 м, диаметр 4,6 мм,

- наполнитель: бутилсилильный силикагель для хроматографии (5 - 10 мкм).

Подвижная фаза:

- подвижная фаза А: 0,06% по объему (об/об) раствор кислоты трифторуксусной

- подвижная фаза В: к 100 мл воды очищенной прибавляют 0,6 мл кислоты трифторуксусной и доводят до 1000 мл ацетонитрилом для хроматографии.

Время (мин.)	Скорость потока (мл/мин.)	Подвижная фаза А (% об/об)	Подвижная фаза В (% об/об)
0 - 10	0,75	100	0
10 - 125	0,75	100 -> 39	0 -> 61
125 - 135	1,25	39 -> 17	61 -> 83
135 - 145	1,25	17 -> 0	83 -> 100
145 - 150	1,25	100	0

Детектирование: длина волны 214 нм

Объем пробы: 50 мкл

Температура колонки: 25°С

Е. Анализ N-концевой последовательности *

Первые 15 аминокислот: Аla-Prо-Prо-Аrg-Lеu-IIe- (не восстановленный пик)-Аsp-Ser-Аrg-Vаl-Lеu-Gly-Arg-Tir.

Проводят деградацию испытуемых образцов по Эдману с использованием автоматического твердофазного секвенатора, действуя в соответствии с инструкциями изготовителя.

Обессоливают 50 мкг эритропоэтина. Например, объем испытуемого препарата, содержащий 50 мкг эритропоэтина, доводят до 1 мл 0,1% раствором (об/об) кислоты трифторуксусной. Предварительно промывают картридж для обращеннофазной хроматографии С 18 в соответствии с инструкцией производителя и уравновешивают 0,1% раствором (об/об) кислоты трифторуксусной.

Испытуемый образец наносят на картридж и последовательно промывают 0,1% раствором (об/об) кислоты трифторуксусной, не содержащий ацетонитрил, 0,1% раствором (об/об) кислоты трифторуксусной содержащие соответственно 10% и 50% растворы (об/об) ацетонитрила. Элюат, содержащий 50% раствор ацетонитрила лиофилизуют.

Обессоленный образец снова растворяют в 50 мкл 0,1% раствора (об/об) кислоты трифторуксусной и наносят на секвенирующий катридж. Проводят 15 последовательных циклов секвенирования, используя при проведении циклов 2 и 3 условия реакции для пролина согласно инструкции производителя.

Методом обращеннофазной жидкостной хроматографии идентифицируют фенилтиогидантоин (ФТГ) - аминокислоты, выделенные в каждом цикле секвенирования. Методика может быть выполнена с использованием колонки и реагентов, рекомендованных изготовителем секвенатора для разделения ФТГ-аминокислот.

Методика разделения калибруется с использованием:

- смеси ФТГ-аминокислот, предоставленных изготовителем секвенатора, в условиях градиента, отрегулированных для достижения оптимального разрешения для всех аминокислот;

- образца, полученного в холостом цикле секвенирования, проведенном в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Прозрачность. Раствор должен быть прозрачным или степень опалесценции не должна превышать эталон 1. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей".

Цветность. Раствор должен быть бесцветным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей".

рН. От 6,5 до 7,5, если в частной фармакопейной статье нет других указаний. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Период наблюдения за животными составляет 7 суток. Тест-дозы препарата для введения животным указывают в частной фармакопейной статье.

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" методом прямого посева или мембранной фильтрации.

Белок. Норма: от 80 до 120% от заявленной концентрации. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой области". Разведение испытуемого образца раствором аммония гидрокарбоната 4 г/л указывают в частной фармакопейной статье. Спектр поглощения регистрируют в диапазоне от 250 нм до 400 нм. Измеряют оптическую плотность при максимуме поглощения при длине волны 276-280 нм, после коррекции на светорассеяние, вплоть до 400 нм. Рассчитывают концентрацию эритропоэтина с учетом величины удельного поглощения 7,43.

Димеры и высокомолекулярные родственные вещества. Общая площадь пиков, элюированных до основного пика - не более площади основного пика на хроматограмме стандартного раствора (2%).

Испытание проводят методом эксклюзионной хроматографии в соответствии с ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография" раздел "Эксклюзионная хроматография".

Методика определения

Хроматографические условия

Колонка: - размеры: длина - 0,6 м; диаметр - 7,5 мм

- наполнитель: силикагель гидрофильный для хроматографии, пригодный для фракционирования глобулярных белков с относительной молекулярной массой от 20 000 до 200 000.

Подвижная фаза: 1,15 г динатрия гидрофосфата безводного, 0,2 г калия дигидрофосфата и 23,4 г натрия хлорида растворяют в 1 л воды (8,1 мМ раствор динатрия гидрофосфат, 1,5 мМ раствор калия дигидрофосфат, 0,4 М раствор натрия хлорид, рН 7,4) при необходимости доводят рН до 7,4 0,1 М раствором натрия гидроксида или 0,1 М раствором кислоты ортофосфорной.

Скорость потока: 0,5 мл/мин.

Детектирование: длина волны 214 нм.

Объем пробы: 100 мкл

Длительность хроматографирования: не менее 1 час.

Пригодность хроматографической системы: площадь основного пика на хроматограмме стандартного раствора должна составлять от 1,5 до 2,5% площади основного пика на хроматограмме испытуемого раствора.

Примечания

Испытуемый раствор: Приготовление испытуемого раствора 0,2 мг/мл указывают в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор: к 0,02 мл испытуемого раствора прибавляют 0,98 мл подвижной фазы и перемешивают.

Раствор используют свежеприготовленным.

Сиаловые кислоты. Не менее 10 молей сиаловых кислот (в пересчете на N-ацетилнейраминовую кислоту) на 1 М эритропоэтина.

Методика определения

Испытание проводят трижды.

По 100 мкл каждого из испытуемых и стандартных растворов вносят в стеклянные пробирки, вместимостью 10 мл. В каждую пробирку прибавляют по 1,0 мл резорцина реактива. Пробирки закрывают пробками и инкубируют при 100°С в течение 30 мин, затем охлаждают на льду. В каждую пробирку прибавляют по 2 мл смеси, состоящей из 12 объемных частей бутанола и 48 объемных частей бутилацетата. Энергично перемешивают и оставляют до разделения фаз. Верхняя фаза должна быть полностью прозрачной. Удаляют верхний слой, избегая попадания какого-либо количества нижней фазы. Измеряют оптическую плотность образцов при 580 нм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 100 мкл воды очищенной и указанные выше реактивы, добавленные в той же последовательности.

Используя калибровочную кривую, построенную с использованием стандартных растворов, определяют содержание сиаловых кислот в испытуемых растворах (а) и (b) и рассчитывают среднее значение.

Рассчитывают количество молей сиаловых кислот на 1 моль эритропоэтина, принимая, что относительная молекулярная масса эритропоэтина равна 30 600 и относительная молекулярная масса N- кислоты ацетилнейраминовой - 309.

Пригодность системы:

- различие между индивидуальными значениями должно находиться в пределах %

- значение, полученное для стандартного раствора (а), должно быть в 1,5-3,3 раза больше значения, полученного для испытуемого раствора (а).

Примечания

Испытуемый раствор (а). Испытуемый препарат разводят до концентрации 0,3 мг/мл раствором, используемым в качестве подвижной фазы при определении показателя "Димеры и высокомолекулярные родственные вещества". Приготовление должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Испытуемый раствор (b). К 0,5 мл испытуемого раствора (а) добавляют 0,5 мл раствора, используемого в качестве подвижной фазы при определении показателя "Димеры и высокомолекулярные родственные вещества".

Стандартный раствор (а). N-ацетилнейраминовую кислоту растворяют в воде очищенной до получения раствора с концентрацией 0,1 мг/мл.

Стандартный раствор (b). К 0,8 мл стандартного раствора (а) прибавляют 0,2 мл воды очищенной.

Стандартный раствор (с). К 0,6 мл стандартного раствора (а) прибавляют 0,4 мл воды очищенной.

Стандартный раствор (d). К 0,4 мл стандартного раствора (а) прибавляют 0,6 мл воды очищенной.

Стандартный раствор (е). К 0,2 мл стандартного раствора (а) прибавляют 0,8 мл воды очищенной.

Стандартный раствор (f). Используют воду очищенную.

Бактериальные эндотоксины. Менее 20 МЕ в объеме, содержащем 100 000 МЕ эритропоэтина. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины". Метод определения указывают в частной фармакопейной статье.

Специфическая активность. Содержание активного вещества должно составлять не менее 80% и не более 125% от заявленного содержания. Доверительные интервалы (Р = 0,95) рассчитанной активности должны быть не ниже 64% и не более 156% от заявленной величины.

Количественное определение основано на измерении стимуляции продукции ретикулоцитов у нормоцитемических мышей.

Определение активности проводят биологическим методом in vivo с использованием нормоцитемических мышей. Активность препарата сравнивают с активностью фармакопейного стандартного образца эритропоэтина BRP и выражают в международных единицах (МЕ).

Методика определения

Испытание проводят на мышах соответствующего возраста и линии (например, мыши линии В6D2F1 в возрасте 8 недель). Рекомендуется распределять по 8 мышей в каждую из 6 клеток, которым вводят одно из разведений препарата. Каждому животному подкожно вводят по 0,5 мл соответствующего раствора препарата. Таким образом, в каждой клетке должны содержаться мыши, получившие один из шести растворов препаратов (3 испытуемых раствора и 3 стандартных раствора). Через 4 дня после введения испытуемых образцов у животных отбирают образцы крови и определяют количество ретикулоцитов, используя одну из указанных методик.

1. Учет результатов испытания с помощью проточного цитофлуориметра.

Цельную кровь, стабилизированную , разводят в 500 раз буферным раствором, используемым для приготовления раствора красителя, в соответствии с указанием в частной фармакопейной статье. Полученный раствор разводят в 2 раза концентрированным раствором красителя. После окрашивания в течение 3-10 минут определяют количество ретикулоцитов микрофлуориметрически в проточном цитометре. Процентное содержание ретикулоцитов определяют, используя параметрическую гистограмму: количество клеток/красная флуоресценция (длина волны 620 нм).

Объем крови, процедура разведения и флуоресцентный реагент при необходимости могут быть изменены с целью обеспечения максимальной флуоресценции и ее стабильности.

2. Визуальный учет результатов испытания.

Отбирают по 0,2 мл крови, которую стабилизируют цитратом, ЭДТА или гепарином, в соответствии с указанием в частной фармакопейной статье. Образцы крови окрашивают путем добавления равного объема готового к употреблению коммерческого 1% раствора бриллиантового крезилового синего. Образцы выдерживают при комнатной температуре в течение 10-30 мин, встряхивают и готовят мазки на предметных стеклах. Учет результатов испытания проводят микроскопически, подсчитывая количество ретикулоцитов не менее чем на 1000 эритроцитов.

Активность препарата рассчитывают, используя метод параллельных линий с помощью соответствующего программного обеспечения, например, PLA 2.0.

Примечания

Указанные ниже растворы готовят перед использованием, хранению не подлежат.

Испытуемый раствор (а). Испытуемый препарат разводят фосфатно-альбуминовым забуференным физиологическим раствором рН 7,2 до концентрации 80 МЕ/мл. Приготовление должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Испытуемый раствор (b). Смешивают равные объемы испытуемого раствора (а) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора рН 7,2.

Испытуемый раствор (с). Смешивают равные объемы испытуемого раствора (b) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора рН 7,2.

Стандартный раствор (а). Стандартный образец эритропоэтина BRP растворяют в фосфатно-альбуминовом забуференном физиологическом растворе рН 7,2 до получения концентрации 80 МЕ/мл. Приготовление должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Стандартный раствор (b). Смешивают равные объемы стандартного раствора (а) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора рН 7,2.

Стандартный раствор (с). Смешивают равные объемы стандартного раствора (b) и фосфатно-альбуминового забуференного физиологического раствора рН 7,2.

Раствор красителя, концентрированный. Используют раствор тиазола оранжевого, пригодного для определения ретикулоцитов. Готовят раствор с концентрацией в два раза большей, чем необходимо для анализа. Приготовление должно быть описано в частной фармакопейной статье.

Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

На упаковке помимо общепринятых сведений должно быть указано:

- наименование и концентрация всех вспомогательных веществ

- указание, что препарат получен с использованием методов генной инженерии.

Транспортирование, хранение. В герметичном контейнере при температуре ниже минус 20°С. Недопустимо повторное замораживание и оттаивание.

______________________________

* Анализ N-концевой последовательности может проводиться не в каждой серии препарата, при условии стабильности производства и соблюдения требований GMP.