Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Бактериофаги лечебно-профилактические"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Бактериофаги лечебно-профилактические"

Вводится впервые

Бактериофаги являются вирусами бактерий. По типу взаимодействия с бактериальной клеткой фаги различаются на вирулентные (вызывающие гибель бактерии) и умеренные (инфицируя бактериальную клетку, встраиваются в генетический аппарат бактерии и репродуцируются в процессе деления клетки). В медицине бактериофаги используют как в диагностических целях для индикации, видового и внутривидового дифференцирования бактерий, так и для лечения и профилактики гнойно-септических и кишечных инфекций.

Данная статья распространяется на бактериофаги лечебно-профилактические, лекарственные средства содержащие комплексы поликлональных вирулентных (строго литических) бактериальных вирусов, которые вызывают гибель гомологичных видов бактерий в очаге воспаления за счет внутриклеточного размножения и разрушения бактериальной клетки, сопровождающегося выходом зрелых фаговых частиц, способных к заражению новых бактериальных клеток.

Лечебно-профилактические бактериофаги представляют собой стерильные очищенные фильтраты фаголизатов соответствующих видов бактерий. Они освобождены от продуктов жизнедеятельности бактерий, эндо- и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальных клеток, белковых и антигенных комплексов питательных сред.

Благодаря строгой специфичности действия лечебно-профилактические бактериофаги, в отличие от антибиотиков, не угнетают нормальную микрофлору, не подавляют иммунной защиты, не обладают токсическим действием и не вызывают аллергизации. На литическую активность бактериофагов не влияет наличие резистентности бактерий к антибиотикам.

Лечебно-профилактические бактериофаги применяют для лечения и профилактики гнойно-воспалительных и кишечных инфекций, коррекции дисбиотических состояний. Главным условием клинической эффективности при назначении бактериофагов является фагочувствительность бактериального возбудителя.

Лечебно-профилактические бактериофаги по своему составу подразделяются на (таблица 1):

- монокомпонентные бактериофаги - лекарственное средство содержащие вирулентные фаги бактерий одного рода или вида;

- комбинированные бактериофаги - лекарственное средство содержащие несколько видов монокомпонентных бактериофагов.

Активность этой группы лекарственных средств выражают в показателях титра максимального разведения, дающий полный фаголизис соответствующих препарату видов бактериальных штаммов, определяемый по методу Аппельмана. Показатели специфической активности для каждого препарата указаны в частных ФС.

Лечебно-профилактические бактериофаги используют для перорального, наружного, местного, ректального применения, интраназального и конъюнктивального введения, введения в дренированные полости. Возможен выпуск в различных лекарственных формах - в растворах, в виде таблеток, суппозиториев, линиментов, мазей.

Таблица 1. Название лечебно-профилактических бактериофагов и их целевая направленность

Наименование препарата бактериофага	Специфическая направленность
Монопрепараты:
Стафилококковый	Staphylococcus (S. aureus)
Стрептококковый	Streptococcus (в том числе Enterococcus)
Псевдомонас аеругиноза (синегнойный)	Pseudomonas aeruginosa
Коли	Escherichia coli
Протейный	Proteus mirabilis и P. vulgaris
Дизентерийный поливалентный	Shigella flexneri 1,2,3,4,6 сероваров; S.sonnei
Брюшнотифозный	Salmonella typhi
Сальмонеллезный гр. АВСДЕ	Salmonella typhimurium; S. paratyphi A, S.paratyphi B, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis, S. dublin,S. enteritidis, S. anatum, S. newlands
Клебсиелл пневмонии	Klebsiella pneumoniae
Комбинированные:
Коли-протейный	Escherichia coli, Proteus mirabilis и P. vulgaris
Клебсиелл поливалентный	Klebsiella pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis
Пиобактериофаг поливалентный очищенный	Staphylococcus, Streptococcus, Proteus mirabilis, P. vulgaris, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae
СекстафагR Пиобактериофаг поливалентный	Staphylococcus, Streptococcus, Proteus vulgaris, P. mirabilis, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E. coli
Пиобактериофаг комплексный	Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus sp., Proteus mirabilis, P. vulgaris, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, K.oxytoca
Интести	Shigella flexneri 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, S. sonnei, Salmonella. typhimurium, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S.infantis, S.dublin S. enteritidis, S. anatum, S. newlands, Proteus mirabilis и P. vulgaris, E.coli, Enterococcus, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa

Особенности производства

Организация производства лечебно-профилактических бактериофагов, как и других иммунобиологических лекарственных средств, осуществляется согласно действующим санитарным правилам, с учетом требований системы обеспечения качества GMP. Вместе с тем имеются определенные особенности в комплектации и размещении производственных помещений.

Для работы со штаммами бактерий, выделенных из разных источников (патологического материала и объектов внешней среды), и для выделения фагов из патологического материала и объектов внешней среды (почва, сточные воды и т.д.) необходимы изолированные от производства боксы для проведения микробиологических исследований.

Обязательными начальными этапами работы являются:

- выделение чистых культур перспективных штаммов бактерий (т.е. кандидатов в производственные штаммы бактерий),

- выделение вирулентных бактериофагов для пополнения коллекции маточных фагов.

В производственной зоне должны быть предусмотрены микробиологические боксы для работы с производственными бактериальными штаммами и маточными фагами.

При производстве фаговых препаратов проводят валидацию технологического процесса, технологического оборудования, сырья и методов контроля. Все исходные материалы и сырье, используемые при производстве, должны иметь сертификаты соответствия. Вспомогательные вещества, входящие в состав лекарственных средств с лечебно-профилактическими бактериофагами, должны быть разрешены к медицинскому применению и использоваться в дозах, не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека.

Питательные среды. Производственные питательные среды не должны содержать антибиотиков и компонентов, вызывающих аллергические или иные нежелательные реакции у человека. Они должны обладать хорошими ростовыми свойствами и быть стерильными. Сырье, реактивы и реагенты, используемые при производстве питательных сред, должны быть разрешены для медицинского применения, должны иметь фармакопейное качество, подтвержденное соответствующими сертификатами.

Требования к производственным штаммам

Производственные штаммы бактерий - продуценты гомологичных бактериофагов, выделяются от больных гнойно-септическими или кишечными инфекциями и получают из бактериологических диагностических лабораторий, расположенных в регионах реализации и потребления лечебно-профилактических бактериофагов. Коллекция производственных штаммов бактерий, используемых в производстве бактериофагов, должна ежегодно обновляться свежевыделенными штаммами от больных не менее, чем на одну треть.

Производственные штаммы бактерий должны обладать типичными для каждого вида морфологическими, культуральными, биохимическими и серологическими свойствами, не продуцировать энтеротоксины и не содержать умеренных бактериофагов.

Производственные штаммы бактерий должны лизироваться маточными фагами в титрах по методу Аппельмана не менее, чем на 1-2 порядка выше показателей специфической активности конечного продукта. При этом стабильность лизиса должна сохраняться после ч инкубирования при температуре 37°С.

Производственные штаммы бактерий хранят в специальных изолированных помещениях в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре 2-8°С в течение 10 лет и в пробирках с 0,4 - 0,7% агаризованной питательной средой (на основе гидролизата Хоттингера, МПБ) под стерильным вазелиновым маслом, при температуре 2-8°С при регулярном пересеве каждые 2 - 3 мес.

Контрольные штаммы бактерий. При определении специфической активности готовых препаратов бактериофагов в качестве контрольных отбирают штаммы из коллекции производственных штаммов бактерий. Они не должны быть использованы при производстве данной серии препарата.

Маточные бактериофаги. Для получения фаговых препаратов используются только вирулентные бактериофаги. Их выделяют из природных источников - клинического материала, сточных вод, почвы, пассируя на штаммах гомологичных видов бактерий - свежевыделенных и производственных. Подбирают высоко активные расы фагов к слаболизирующимся и фагорезистентным штаммам бактерий. Пополнение производственных маточных фаговых рас литическими штаммами из природных источников позволяет преодолевать первичную фагоустойчивость возбудителей.

Маточные бактериофаги должны включать только вирулентные фаги с широким диапазоном действия по отношению к штаммам гомологичного вида бактерий, обладать высокой активностью, стабильностью лизиса, специфической направленностью антимикробного действия и высокой урожайностью. Характеристика кандидатых фаговых рас (штаммов) при отборе может быть дополнена электронно-микроскопическим изучением их морфологии и другими современными молекулярно-биологическими методами (анализ фаговой ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирование последовательностей генома). Хранение маточных бактериофагов осуществляется при температуре от 2 до 8°С в течение 5 лет с ежегодным пересевом на гомологичных бактериальных штаммах.

Работа с производственными штаммами бактерий и бактериофагов, а именно - регулярное пополнение производственных бактериальных штаммов за счет клинических изолятов и подбор к ним фаговых рас из природных источников, все это обеспечивает возможность адаптации лечебно-профилактических бактериофагов к циркулирующим бактериальным возбудителям. Таким образом, возможен выпуск производственных серий бактериофагов целевого назначения. Например, при вспышечной или очаговой заболеваемости инфекцией, обусловленной фагоустойчивым возбудителем, передача на производство эпидемически значимого бактериального штамма позволит адаптировать препарат к конкретным эпидемиологическим условиям.

Диапазон действия лечебно-профилактических бактериофагов, их активность в отношении современных возбудителей бактериальных инфекций во многом зависят от организации сбора клинических штаммов.

Краткое описание технологического процесса

Производственный процесс включает основные этапы: работа с бактериальными возбудителями гнойно-септических и кишечных инфекций, подбор к ним активных фаговых рас, работа с коллекцией производственных бактериальных штаммов, регулярно пополняемых свежевыделенными.

Культивирование бактериофагов проводят в реакторах (ферментерах) путем посева производственных штаммов бактерий и маточных фагов, содержащих несколько высокоактивных фаговых рас. После завершения процесса фаголизиса культуральную суспензию, для очистки фаголизатов от лизированных бактериальных клеток, их метаболитов, в том числе энтеротоксинов, и белковых компонентов питательной среды, пропускают через микрофильтрационные установки, подвергая ультрафильтрации и концентрированию с последующей стерилизующей фильтрацией. Далее из полученного стерильного концентрата фаголизатов готовят жидкий препарат, путем разведения 0,9% раствором хлорида натрия со стабилизаторами (магния хлорид, желатин), или получают лиофилизированную биомассу, предназначенную для получения таблеток (лиофилизируя концентрат фаголизатов при соответствующих условиях).

В процессе производства бактериофагов на разных этапах получают промежуточные продукты, которые должны соответствовать определенному уровню качества, а именно:

- подготовка производственных штаммов бактерий - контроль посевных культур бактериальных штаммов - продуцентов на чистоту, типичность биологических свойств, на отсутствие умеренных бактериофагов;

- подготовка маточных бактериофагов - контроль маточных бактериофагов на содержание фаговых частиц в мл по методу Грациа, на посевных бактериальных штаммах по методу Аппельмана на специфическую активность и на стабильность лизиса (сохранность полученных результатов лизиса в течение 48 ч инкубации при °С), на стерильность.

В завершающей стадии культивирования в реакторах наступление полного фаголизиса определяют визуально - отсутствие видимого бактериального роста;

По мере завершения очистки фаголизатов методом ультрафильтрации и концентрирования, стерилизующей фильтрации проводится определение следующих показателей: рН, стерильность, специфическая активность по методу Аппельмана, аномальная токсичность.

Для получения жидкого препарата после финальной стадии бактериофаг разливают по флаконам и укупоривают.

Для получения препаратов в таблетках:

а) в концентрированный бактериофаг добавляют стабилизаторы и лиофилизируют. Сухую массу бактериофага контролируют в тестах на специфическую активность и микробиологическую чистоту;

б) после добавления наполнителей проводится таблетирование. Стабилизаторы и наполнители перед соединением с бактериофагом проверяют на микробиологическую чистоту. В качестве вспомогательных веществ используют пектин, глюконат кальция, глюкозу, тальк, стеарат кальция. Таблетки проверяют на ломкость, отсутствие дефектов (сколов, расслоений), определяют среднюю массу таблеток;

в) после завершения фасовки таблеток готовый продукт контролируют по всем показателям: описание (внешний вид таблеток), подлинность и специфическая активность, средняя масса таблетки, распадаемость, потеря в массе при высушивании, микробиологическая чистота, аномальная токсичность.

К специфическим методам исследования, используемым для характеристики лечебно-профилактических бактериофагов, относятся методы Аппельмана и Грациа.

Определение специфической активности бактериофагов и стабильности лизиза по методу Аппельмана. Специфическую активность бактериофагов и стабильность лизиса по методу Аппельмана определяют с использованием гомологичных тест-штаммов бактерий (контрольных штаммов). Показатели специфической активности указывают в частной фармакопейной статье. Контрольные штаммы отбирают из коллекции производственных штаммов бактерий. Они не должны быть использованы при производстве данной серии препарата. Состав питательного бульона указывают в частной фармакопейной статье.

Методика анализа:

Испытания проводят, соблюдая правила асептики. В пробирках, содержащих по 4,5 мл питательного бульона (мясо-пептонного бульона, бульона Хоттингера), готовят ряд последовательных десятикратных разведений бактериофага от до - (в зависимости от показателей специфической активности, заложенных в частную ФС) с обязательной сменой пипеток при каждом разведении. Посевы инкубируют в том же режиме еще ч. бульона (мясо-пептонного бульона, бульона Хоттингера), взятого для титрования с обязательной сменой пипеток при каждом разведении. Первым разведением является 0,5 мл образца препарата в 4,5 мл бульона. В качестве контроля используют пробирку с 4, 5 мл бульона без фага. Во все пробирки пипеткой добавляют по 0,03 мл взвеси суточной агаровой культуры, содержащей 109 микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности (10 МЕ.). Результаты учитывают через ч инкубации при температуре °С. Возможны варианты длительности инкубации, о чем указывают в частной ФС. Активность бактериофага обозначают отрицательной степенью десяти, где степень указывает последнее разведение бактериофага, в котором рост контрольного штамма визуально не наблюдается. Для определения стабильности лизиса срок инкубации продлевается до двух суток, т.е. после учета результатов специфической активности штативы с пробирками

Определение фаговых частиц в мл по методу Грациа (на плотных питательных средах двухслойным методом). Мясо-пептонный 1,5% агар разливают в чашки Петри по  мл (первый слой). Перед использованием чашки подсушивают в перевернутом виде с прикрытой крышкой при температуре °С в течение 30-60 минут. Для титрации используют посевные штаммы бактерий, гомологичные титруемому бактериофагу. Готовят десятикратные последовательные разведения маточного фага в мясо-пептонном бульоне по методу Аппельмана от до или выше, в зависимости от специфической направленности бактериофага). По 1 мл разведенного фага из пробирок с разведениями смешивают с 5 мл расплавленного и остуженного до температуры 45°С 0,7% мясо-пептонного агара, затем добавляют  мл 18-часовой бульонной культуры посевного штамма, подготовленного с суточной культуры, выращенной на плотной питательной среде, в соответствии с требованиями к производственным бактериальным штаммам. Содержимое пробирок перемешивают быстро и аккуратно вращением между ладонями, чтобы не произошло застывания агара, и выливают вторым слоем на поверхность 1,5% агара в чашках Петри. После застывания верхнего слоя агара чашки инкубируют в течение 18 ч при температуре °С. Для определения концентрации фаговых частиц в маточном фаге подсчитывают количество негативных колоний (прозрачные пятна на матовом фоне глубинного роста бактерий) на каждой чашке, умножают на коэффициент разведения фага в пробирке с соответствующим разведением. Затем вычисляют среднее значение из 3-х определений.

Данная методика используется при отборе перспективных фаговых рас в коллекцию маточных бактериофагов. От вида бактериофагов зависит порядок применяемых в опыте разведений.

рН. Допустимые пределы 6,6-7,8. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Потенциометрическое титрование".

Стерильность. Очищенный и концентрированный фильтрат фаголизатов должен быть стерильным. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Стерильность".

Аномальная токсичность. Введение мышам очищенного фильтрата фаголизатов не должно вызывать гибель животных. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Тест- доза 1 мл подкожно.

Лечебно-профилактические бактериофаги выпускают в лекарственной форме - раствор, таблетка.

Испытания готовых препаратов

Контроль показателей качества лечебно-профилактических бактериофагов включает в себя физические, биологические и микробиологические методы.

Проводят необходимые испытания, предусмотренные для лечебно-профилактических бактериофагов в соответствующей лекарственной форме.

Описание. Приводится описание физических свойств соответствующей лекарственной формы лекарственного средства. Испытание проводят визуально.

Подлинность. Подлинность препарата подтверждается его специфической активностью.

рН (для растворов). Допустимые пределы 6,6-7,8. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Извлекаемый объем (для растворов). Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем".

Средняя масса и отклонения от средней массы (для таблеток). Приводятся требования к средней массе и максимально допустимые отклонения от средней массы в соответствии с ОФС "Однородность массы дозированных лекарственных форм".

Время распадаемости (для таблеток). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Распадаемость таблеток и капсул".

Время распадаемости таблеток не должно превышать 30 мин, если в частной фармакопейной статье не указаны другие требования.

Лечебно-профилактические бактериофаги могут выпускаться в виде кишечнорастворимых таблеток. Они не должны распадаться в течение 1 часа в растворе кислоты хлористоводородной (0,1 моль/л) и после промывания водой должны распадаться в растворе натрия гидрокарбоната (рН от 7,5 до 8,0) в течение 30 мин.

Потеря в массе при высушивании (для таблеток). Показатель потери в массе при высушивании для таблетированных лекарственных форм не должен превышать 4%, если не указано иначе в частной фармакопейной статье. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Стерильность (для растворов). Категория 5БII. Препарат должен быть стерильным. Испытание стерильности проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность".

Микробиологическая чистота (для таблеток). Категория 5БII:

- Общее число аэробных бактерий - не более 10^2 КОЕ в единице препарата

- Отсутствие дрожжевых и плесневых грибов,

- Отсутствие энтеробактерий в единице препарата,

- Отсутствие Pseudomonas aeruginosa в единице препарата/ мл,

- Отсутствие Staphylococcus aureus в единице препарата/ мл.

Испытание проводят в соответствие с ОФС "Микробиологическая чистота".

Аномальная токсичность. Введение мышам подкожно 1 мл препарата не должно вызывать гибель животных. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Пробоподготовку препаратов указывают в частной статье.

Специфическая активность. Показатели активности приводятся в частной фармакопейной статье. Определение проводят титрованием в жидкой питательной среде по методу Аппельмана. Активность бактериофага обозначают отрицательной степенью десяти, где степень указывает последнее разведение бактериофага, в котором рост контрольных штаммов визуально не наблюдается. Подготовку проб описывают в частной фармакопейной статье.

Упаковка и маркировка. Раздел оформляется в соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства". В маркировке лекарственной формы растворы должна быть предусмотрена предупредительная надпись "При помутнении не применять".

Транспортирование при температуре от 2 до 8°С, допускается при температуре от 9 до 25°С в пределах одного месяца.

Хранение. В сухом, защищенном от света месте, при температуре от 2 до 8°С в течение 2 лет.