Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная сорбированная, жидкая или сухая в комплекте с растворителем - алюминия гидроксида"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная сорбированная, жидкая или сухая в комплекте с растворителем - алюминия гидроксида"

Вводится впервые

Данная фармакопейная статья распространяется на вакцину клещевого энцефалита инактивированную формальдегидом культуральную цельновирионную очищенную концентрированную, которая представляет собой вирусный антиген (в основном, протективный поверхностный белок вириона - белок Е), сорбированный на минеральном сорбенте - алюминия гидроксиде, жидкую или сухую с алюминием гидроксида в качестве растворителя.

Вакцина не содержит формальдегида, антибиотиков и консервантов.

Производство

Состав: Одна доза вакцины содержит специфический инактивированный антиген вируса клещевого энцефалита (КЭ) - активный компонент, может содержать вспомогательные вещества (содержание расчетное) предусмотренные частной фармакопейной статьей.

Производство вакцины клещевого энцефалита должно быть организовано при соблюдении условий GMP, а также условий работы с вирусом 2 группы биоопасности (патогенности) - вирусом клещевого энцефалита.

Технология производства вакцины состоит из нескольких этапов:

1. Подготовка и ведение производственного штамма вируса клещевого энцефалита;

2. Подготовка и ведение первично-трипсинизированной культуры клеток куриного эмбриона (взвешенной или монослойной);*

3. Заражение клеточной культуры, репродукция вируса и получение вирусного сбора;

4. Инактивация вирусного сбора формальдегидом, проведение технологии очистки и концентрации вакцинного вирусного антигена, стабилизация альбумином человеческим и сахарозой, получение готовой формы вакцины - сорбция полученного антигена на сорбенте - алюминия гидроксиде или лиофилизация вакцинного антигена.

В производстве вакцины размножение вируса осуществляется на первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы должны поступать из проверенных и аттестованных на отсутствие заболеваний среди птицы птицеводческих хозяйств. Перед заражением вирусом получаемые клетки - фибробласты куриного эмбриона должны быть проверены на отсутствие контаминирующих агентов - вирусов, бактерий, грибов, микоплазм. Для заражения вирусом клещевого энцефалита используют монослойные или взвешенные культуры клеток куриного эмбриона.

- В качестве субстрата для приготовления вакцины КЭ могут быть использованы перевиваемые клеточные линии рекомендованные ВОЗ для этой цели, в частности, перевиваемая клеточная линия клеток VERO.

Очищенный концентрированный вакцинный антиген получают на основе вирусного сбора, который представляет собой вирус клещевого энцефалита репродуцированный в первично-трипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона. Для получения вирусного сбора используются производственные штаммы вируса клещевого энцефалита, полученные путем пассирования вируса клещевого энцефалита, выделенного из клещей или от больных КЭ людей, через мозг беспородных белых мышей. Для ведения производственного штамма используется система посевных серий, от лиофилизированного производственного штамма, который хранится при температуре минус 60 0С, до получения вакцинного вирусного сбора допустимо проведение не более 3 пассажей вируса через мозг мышей. Полученный культуральный вирусный сбор подвергается инактивации формальдегидом. После контроля инактивированного материала на отсутствие живого вируса клещевого энцефалита, проводят процедуры очистки и концентрации вакцинного антигена - методом ультрафильтрации с гель-хроматографией, достигая очистки вакцинного антигена от субстратных балластных примесей более, чем на 98%.

Для повышения иммуногенных свойств вакцинного антигена проводится сорбция антигена на сорбенте - алюминия гидроксиде. Существует другая технология получения конечной формы вакцины - лиофилизация очищенного вакцинного антигена, который перед применением для вакцинации людей восстанавливается растворителем - сорбентом алюминия гидроксидом. При изготовлении готовой формы вакцины применяются стабилизаторы активности очищенного концентрированного вакцинного антигена - 10% или 20% растворы альбумина человека и сахароза (в концентрации предусмотренной частной фармакопейной статьей). Перед использованием в производстве альбумин человека должен тестироваться валидированными методами на отсутствие антител к ВИЧ, ВИЧ-2, к вирусу гепатита С и поверхностному антигену вируса гепатита В (HbsAg).

Испытание готового препарата.

Описание. Гомогенная суспензия белого цвета (для сорбированной жидкой вакцины). Пористая масса белого цвета, гигроскопична (для лиофилизированной вакцины). Определение проводят визуально.

Подлинность. Должна вызывать специфический иммунитет к вирусу клещевого энцефалита при иммунизации мышей линии BALB/С.

Определение проводят биологическим методом (раздел "Специфическая активность").

Время растворения. Не более 3 мин (для лиофилизированной вакцины)

Определение проводят визуально по методике, указанной в частной фармакопейной статье.

Описание восстановленного препарата. Гомогенная непрозрачная суспензия белого цвета (для лиофилизата после внесения растворителя для вакцины), при отстаивании разделяющаяся на бесцветную прозрачную жидкость и рыхлый осадок белого цвета. При встряхивании хлопья, конгломераты и посторонний частицы должны отсутствовать.

Определение проводят визуально.

Механические включения. Должны отсутствовать. Определение проводят визуально по ОФС "Видимые механические включения в парентеральных лекарственных формах и глазных лекарственных формах"

Цветность. Суспензия белого цвета (для жидкой сорбированной вакцины и для лиофилизата после внесения растворителя для вакцины). Определение проводят визуально по ОФС "Степень окраски жидкостей"

Время седиментационной устойчивости. Суспензия, образующаяся при встряхивании, не должна расслаиваться в течение 3 мин (для жидкой сорбированной вакцины и лиофилизата после внесения растворителя для вакцины). Определение проводят визуально.

Количественное определение антигена. Определение проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов реагентов для выявления антигенов вируса клещевого энцефалита. Подготовка образцов вакцины должна быть изложена в частной фармакопейной статье. Проведение ИФА и учет результатов проводят согласно инструкции по применению набора реагентов. Титр антигена в вакцине КЭ должен быть не менее 1:128.

Извлекаемый объём. Должен быть не менее номинального (для жидкой сорбированной вакцины). Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения"

Потеря в массе при высушивании. Не более 2,5% (для лиофилизированной вакцины). Определение проводят весовым методом в соответствии с ОФС "Определение потери в массе при высушивании"

Алюминий. От 0,60 до 1,0 мг/мл (для жидкой сорбированной вакцины)

Определение проводят комплексонометрическим методом в соответствии с ОФС "Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических препаратах".

Сахароза. От 20 до 60 мг/мл (для жидкой сорбированной вакцины)

Определение проводят колориметрическим методом в соответствии с ОФС "Определение сахаров спектрофотометрическим методом".

Формальдегид. Должен отсутствовать (определение проводят в жидкой сорбированной вакцине колориметрическим методом в соответствии с ОФС "Определение формальдегида".

Стерильность. Должна быть стерильной. Определение проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность".

Присутствие микоплазм. Не должна содержать микоплазм. Определение проводят микробиологическим методом по методике, изложенной в частной фармакопейной статье.

Бактериальные эндотоксины. Не более 50 ЕЭ/мл. Определение проводят методом гель-тромб тест в соответствии с ОФС: "Бактериальные эндотоксины".

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксична. Определение проводят в соответствии с ОФС: "Аномальная токсичность". Тест-доза: морским свинкам - 1 доза вакцины подкожно, белым мышам по 1дозе вакцины внутрибрюшинно, период наблюдения за животными составляет 7 сут.

рН (восстановленного препарата для лиофилизированной вакцины).

От 7,4 до 7,8. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Специфическая активность (иммуногенность). Должна быть специфически активна. Минимальная иммунизирующая доза вакцины (МИД50) должна быть в пределах от 0,001 до 0,017 мл. Определение проводят биологическим методом:

Для проведения контроля используют 3-6 образцов вакцины. В качестве препарата сравнения применяется стандартный образец вакцины клещевого энцефалита, аттестованный в установленном порядке. Содержимое 3-6 ампул вакцины или стандартного образца объединяют в одной ёмкости и готовят ряд разведений: 1:10; 1:32; 1:100; 1:320 (для лиофилизированной вакцины КЭ содержимое ампул предварительно растворяют в растворителе (предложенном частной фармакопеей). Для приготовления разведений используют среду 199 с 0,1% ЧСА или другую предложенную, частной фармакопеей. Ёмкости с приготовленными разведениями испытуемой вакцины и стандартного образца вакцины сохраняют на льду на время постановки опыта.

Для иммунизации готовят используют мышей линии BALB/С массой 14 -16 г, возрастной категории 40 - 42 сут, без различия пола. Каждым разведением испытуемой вакцины или стандартного образца вакцины иммунизируют не менее 10 мышей. Иммунизацию проводят трёхкратно с интервалом между инъекциями 1 - 2 сут. Животным вводят подкожно соответствующие разведения в объеме разовой дозы вакцины. Для каждой иммунизации готовят свежие разведения испытуемой вакцины и стандартного образца вакцины.

Одновременно, в первый день иммунизации, комплектуют контрольную группу мышей той же партии для определения рабочей дозы тест-штамма вируса клещевого энцефалита. В качестве тест-штамма используют вирулентный штамм "Абсеттаров" вируса клещевого энцефалита.

Через 7 - 9 сут после 3 иммунизации, мышам внутрибрюшинно вводят по 100 - 1000 ЛД50 тест-штамма "Абсеттаров" в объёме 0,25 мл каждому животному. Параллельно, для подтверждения рабочей дозы вируса, или РЛД50 (реальной летальной дозы) для мышей, готовят десятикратные разведения рабочей дозы (РЛД50), введенной иммунизированным мышам: неразвед. раб.доза; 1 : 10; 1: 100; 1 : 1000 на том же разбавителе, который использовался для приготовления разведений вакцины, стандартного образца и рабочей дозы вируса. Указанные выше разведения РЛД50 вируса вводят мышам контрольной группы внутрибрюшинно, по 0,25 мл, используя по 6 мышей на каждое разведение вируса.

За животными ведут ежедневное наблюдение и регистрируют заболевших и павших мышей. Мышей павших в течение первых трёх сут после заражения вирусом исключают из опыта. Учёт результатов проводят на 14 сут после введения вируса.

На основании полученных результатов рассчитывают реальную летальную дозу (РЛД50) вирулентного вируса тест-штамма "Абсеттаров", введенного иммунизированным животным испытуемой вакциной или стандартным образцом мышам, а также МИД50 (минимальная иммунизирующая доза) для данных вакцин.

1. Определение РЛД50 вируса тест-штамма "Абсеттаров".

РЛД50 вируса, введенная иммунизированным мышам, должна содержать от 100 до 1000 ЛД50/ 0,25 мл. Расчёт проводят по методу Рида и Менча.

Пример расчёта:

Определение реальной дозы вируса тест-штамма "Абсеттаров", использованной для испытания иммуногенности испытуемой серии вакцины или стандартного образца вакцины -

Разведение вируса	Количество мышей					% гибели
	всего	Абсолютные данные		Кумулятивные данные
		погибло	выжило	погибло	Выжило
- "рабочее" разведение	10	10	0	29	0
	10	10	0	19	0	100
(В)	10	6	4	9	4	69(в)
	10	3	7	3	11	21(а)
	10	0	10	0	21

, где

В - наибольшее разведение вируса, при котором наблюдается гибель более 50% животных;

в - процент летальности мышей при данном (В) разведении вируса;

а - процент летальности мышей при наименьшем разведении вируса, вызвавшем гибель менее 50% животных.

Следовательно, рабочая доза вируса, введенная мышам при испытании иммуногенности, содержала 251 ЛД50 вирулентного тест-штамма "Абсеттаров" вируса клещевого энцефалита в объёме 0,25 мл.

2. Определение МИД50.

МИД50 - это минимальная иммунизирующая доза, которая выражается как отношение объема разовой дозы вакцины выраженное в мл к показателю ПР50 (предельное разведение вакцины)

Для определения МИД50 испытуемой серии или стандартного образца вакцины (ОСО или СОП) предварительно, по методу Рида и Менча, вычисляют предельное разведение вакцины, обеспечивающее защиту 50% иммунизированных мышей (ПР50).

Пример расчёта:

Определение МИД50 вакцин или ОСО

Разведение вируса	Количество мышей					% гибели
	всего	Абсолютные данные		Кумулятивные данные
		погибло	Выжило	погибло	Выжило
1:10	10	0	10	0	18	38,5 (а) 81,3 (в)
1:32 (А)	10	5	5	5	8
1:100	10	8	2	13	3
1:320	10	9	1	22	1

 (мл), где

А - наибольшее разведение вакцины, защищающее при иммунизации более 50% мышей от гибели;

а - процент летальности мышей при иммунизации вышеуказанной дозой вакцины (А);

в - процент летальности мышей при иммунизации наименьшим разведением вакцины, защищающим от гибели менее 50% мышей;

- предельное разведение вакцины, вызывающее защиту 50% мышей при введении от 100 до 1000 вируса.

При неудовлетворительных результатах определение специфической активности (иммуногенности) повторяют, используя такое же количество образцов.

Предупреждение! Выполнение контроля "Специфической активности" вакцины связано с потенциальной опасностью заражения вирусом клещевого энцефалита. Необходимо соблюдать санитарные правила

"Безопасность работы с микроорганизмами 1 - 2 групп патогенности (опасности)".

Полнота сорбции антигена. Полнота сорбции антигена вируса клещевого энцефалита должна составлять от 80 до 100%. Метод предназначен для жидкой сорбированной вакцины.

Определение проводят методом иммуноферментного анализа по соотношению иммуноферментной активности вакцинного антигена в образцах готовой формы вакцины и в надосадочной жидкости после центрифугирования образцов вакцины. Определение проводят по методике, изложенной в частной фармакопейной статье.

Расчёт полноты сорбции антигена.

Для расчёта полноты сорбции (ПС) вакцинного антигена на сорбенте - алюминия гидроксида вычисляют относительную активность антигена вируса клещевого энцефалита в надосадочной жидкости, сравнивая показатели ОП - оптические плотности разведений испытуемых образцов сорбированной вакцины и надосадочной жидкости по компьютерной программе "PARALINE".

Полноту сорбции антигена вируса КЭ определяют как разницу между 100% (активность антигена в испытуемом образце вакцины) и полученным значением активности антигена в надосадочной жидкости (в%) по формуле:

, где

А - значение относительной активности вируса КЭ в надосадочной жидкости испытуемой вакцины, рассчитанное по компьютерной программы "PARALINE".

Если по результатам ИФА во всех пробах надосадочной жидкости испытуемой вакцины антиген вируса КЭ не выявляется (ОП проб ниже ОП крит.), то полнота сорбции вакцинного антигена в готовой вакцине равна 100%, без проведения вычислений.

Производственные штаммы и тест - штаммы

Для производства вакцины и контроля иммуногенности вакцины по методу "Специфическая активность", должны использоваться вирулентные штаммы вируса клещевого энцефалита, выделенные из вирофорных клещей или от больных клещевым энцефалитом людей.

Штаммы должны быть депонированы в официальной Государственной коллекции вирусов. Штаммы в качестве производственных или тест-штаммов должны быть закреплены на установленном уровне пассажей, лиофилизированы и заложены на долгосрочное хранение.

При ведении штаммов на производстве должна использоваться система посевных серий, т.е. от исходного штамма до производства вакцины должно быть проведено не более 3 пассажей через мозг беспородных белых мышей. На каждом пассаже при приготовлении материала для очередного пассирования - штаммовый запас, первичный посевной вирус, вторичный посевной вирус - должен проводиться контроль стерильности, биологической активности и типоспецифичности вируса.

Вакцинный производственный штамм и тест-штамм вируса клещевого энцефалита должны отвечать следующим требованиям:

- не должны содержать контаминирующих агентов;

- индекс нейтрализации типоспецифическими иммунными сыворотками к вирусу клещевого энцефалита в реакции нейтрализации при внутримозговом заражении беспородных белых мышей массой 7 - 9 г, возрастной категории 12 - 14 сут, не менее 1000;

- титр вируса при внутримозговом заражении беспородных белых мышей массой 7 - 9 г, возрастной категории 12 -14 сут - не менее 8,5 - 9,0 lg ЛД50/мл, при подкожном и внутрибрюшинном заражении мышей той же категории титр не менее 7,5 lg ЛД50/мл.

Растворитель, выпускаемый в комплекте с препаратом (для лиофилизированной вакцины). В состав растворителя входят гель - алюминия гидроксида от 0,60 до 1,0 мг/мл и вода для инъекций до 1 мл.

Описание. Гомогенная непрозрачная суспензия белого цвета, при отстаивании разделяющаяся на бесцветную прозрачную жидкость и рыхлый осадок белого цвета. При встряхивании хлопья, конгломераты и посторонний частицы должны отсутствовать. Определение проводят визуально.

Содержание алюминия. От 0,60 до 1,0 мг/мл. Определение проводят комплексонометрическим методом в соответствии с ОФС "Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических препаратах"

рН. От 5,5 до 8,5. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Дисперсность. От 0,6 до 1,4. Определение проводят спектрофотометрическим методом в соответствии с ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиалетовой и видимой областях"

Стерильность. Должен быть стерильный. Не должен содержать бактерии и грибы. Определение проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации по ОФС "Стерильность".

Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичен. Определение проводят по ОФС: "Аномальная токсичность". Тест-доза: морским свинкам - 1,0 мл подкожно, белым мышам - 0,5 мл внутрибрюшинно.

Извлекаемый объём. Должен быть не менее номинального. Определение проводят по ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Упаковка и маркировка. Определение проводят в соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства". Дополнительно указывают предупредительные надписи: "Стерильно", "Перед употреблением встряхивать", "Замораживание не допускается", "Хранить в недоступном для детей месте".

"Препарат не содержит консервантов и антибиотиков".

Транспортирование.

При температуре от 2 до 8°С.

Хранение.

В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".