Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин"

Вводится впервые

Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин определяют путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella рertussis 18323 по методу Kendrick (1947).

Разовая доза для человека (0,5 мл) должна содержать не менее 4 МЕ.

Материалы:

Животные:

Здоровые мыши массой тела  г одной линии и одного пола. Могут быть использованы аутбредные мыши. Если используют животных обоего пола, то их следует равномерно распределять по всем испытуемым группам. В одном опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г.

Референс- препараты:

- стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины, калиброванный в МЕ по соответствующему утвержденному Международному стандарту коклюшной вакцины;

- стандартный образец мутности 10 МЕ, калиброванный в Международных оптических единицах (МЕ).

Тест-штамм:

B. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии, используют только в качестве тест-штамма для заражения иммунизированных мышей. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно.

Испытуемая вакцина

Среды:

Среда Борде-Жангу:

Приготовление среды Борде-Жангу

Состав среды на 1 л:

картофельный отвар с глицерином - 0,5 л

агар микробиологический - 25 г

вода очищенная - 1,0 л

магний сернокислый - 0,0375 г

калия хлорид - 0,75 г

калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,375 г

калий фосфорнокислый двузамещенный - 1,125 г

натрия хлорид - 3,75 г.

Для получения картофельного отвара белый рассыпчатый картофель моют водой питьевой и чистят. 0,5 кг очищенного картофеля мелко нарезают, добавляют 1 л воды очищенной и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и варят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля (1,0 - 1,5) ч. Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку.

25 г агара микробиологического помещают в 250 мл воды очищенной и расплавляют в автоклаве при прогревании текучим паром 45 мин и давлении 0,6 .

Смешивают 0,5 л картофельного отвара, 250 мл раствора агара и навески солей. Доводят объем водой очищенной до 1 л, тщательно перемешивают. Доводят рН до 20% раствором натрия гидроксида. Среду разливают по  мл в стерильные флаконы емкостью 500 мл и стерилизуют при 110°С 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8°С не более 3 мес при условии предохранения среды от высыхания.

Для внесения крови среду во флаконе растапливают и в охлажденную до 50-55°С среду вносят 60 мл крови человека, содержимое перемешивают и разливают в чашки Петри и пробирки. Срок хранения среды с кровью - 14 сут при температуре от 2 до 8°С при условии предохранения среды от высыхания.

Примечание:

Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие инфекций, переносимых при гемотрансфузиях, согласно "Инструкции по заготовке и консервированию донорской крови", утверждённой МЗ РФ 29.05.1995 г., Дополнения к ней от 02.08.1999 г., "Инструкции по проведению донорского прерывистого плазмафереза", утверждённой МЗ РФ 23.09.2002 г. Срок хранения крови не более 2 сут.

Среда КУА:

Приготовление среды КУА

Состав среды на 1 л:

Гидролизат казеина -  мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержание аминного азота составляло от 150 до160 мг%; в готовом гидролизате должно содержаться аминного азота 850-1000 мг%, общего азота 910-1080 мг%, хлоридов 4-6%)

дрожжевой диализат -  мл

- 0,5 г

- 0,4 г

крахмал растворимый - 1,5 г

- 0,01 г

- 0,01 г

- 0,005 г

цистеин - 0,03 г

агар - г

уголь активированный - 2 г.

В среде содержание хлоридов должно составлять %, аминного азота  мг%, рН доводят до 7,0-7,1 с помощью 20% раствора натрия гидроксида.

Среду разливают в матрацы по  мл, пробирки по  мл и флаконы емкостью 500 мл по  мл. Среду стерилизуют 30 мин при 110°С.

Хранят при температуре от 2 до 8°С не более 1 мес при условии предохранения среды от высыхания.

Для внесения крови среду во флаконе растапливают и в охлажденную до

50-55°С среду вносят 20 мл крови человека, содержимое перемешивают и разливают в чашки Петри и пробирки. Срок хранения среды с кровью - 14 сут при температуре от 2 до 8°С при условии предохранения среды от высыхания.

1% раствор гидролизата казеина:

Гидролизат казеина - 10 мл; натрий хлористый - 6 г; вода очищенная - до 1000 мл. рН доводят до с помощью 20% раствора натрия гидроксида. Среду стерилизуют 15 мин при 121°С. Срок хранения - 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 дней.

Метод исследования иммуногенной активности коклюшной вакцины.

Перед иммунизацией за животными наблюдают 1 - 2 сут - период ак-климатизации после транспортирования. При гибели более 10% животных всю партию мышей бракуют.

Мышей распределяют в группы по 18-20 голов: по три группы для испытуемого и референс препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма B. pertussis 18323 из этой же партии животных формируют четыре группы по 10 мышей в каждой.

Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках и порядок введения разрешающей дозы.

Иммунизация мышей

Готовят по три пятикратных разведения испытуемого и референс-препарата. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида рН . В интервале используемых разведений каждого препарата должна содержаться средняя эффективная доза .

В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 МЕ (разведение I). Из разведения I делают два последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).

Образец испытуемой вакцины разводят растворителем в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают два последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если фактическое испытуемой вакцины будет больше избранной, то необходимо изменить разведение I (например, 1:10).

Приготовленные разведения хранят при °С и они должны быть использованы в течение 4 часов.

Таблица 1 - Пример разведения референс-препарата

Разведения	Количество в мл		Кратность разведений исходной (сухой) вакцины (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза 0,5 мл
	Объем вносимого разведения I вакцины	Объем вносимого растворителя		в мл исходной вакцины (референс-препарата)	в МЗЕ
I	15	0	1:60	0,0167	0,5
II	2,5	10,0	1:300	0,0033	0,1
III	0,5	12,0	1:1500	0,00066	0,02

Таблица 2 - Пример разведения испытуемой вакцины

разведения	Количество в мл		Кратность разведений исходной вакцины (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза в объеме 0,5 мл
	Объем вносимого I разведения вакцины	Объем вносимого растворителя		в мл исходной вакцины	в МЕ (предполагаемое содержание)
I	14	0	1:28	0,0357	0,5
II	2,5	10,0	1:140	0,0071	0.1
III	0,5	12,0	1:700	0,00142	0,02

Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл соответствующего разведения. Интервал между иммунизацией и введением заражающей дозы должен составлять 14-17 сут. К моменту введения заражающей дозы в живых и без признаков заболевания должно остаться не менее 94% иммунизированных мышей. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.

Приготовление заражающей суспензии B. рertussis 18323

Бактериальную суспензию тест-штамма B. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20-24-часовой культуры второго-третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу с кровью человека или КУА с кровью человека.

Для проверки морфологической характеристики и подтверждения отсутствия полиморфизма и контаминации посторонней микрофлорой из выросшей культуры делают мазки, которые окрашивают по Граму. Культура должна быть морфологически однородной и не содержать посторонней микрофлоры.

Культуру с поверхности питательной среды снимают стеклянной пипеткой Пастера и суспендируют в стерильной пробирке, содержащей стерильный 0,9% раствор натрия хлорида рН . Небольшое количество культуры пипеткой Пастера тщательно растирают на внутренней поверхности, смоченной содержимым пробирки, до гомогенной массы и осторожно смывают со стенки. Операцию продолжают до получения суспензии мутностью 10 МЕ/мл по стандартному образцу мутности 10 МЕ. Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% натрия хлорида рН .

Микробную суспензию, мутностью 10 МЕ в 1 мл (разведение А в табл. 3), разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл. Из рабочей суспензии делают разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл.3).

Таблица 3 - Пример разведения вирулентного штамма коклюшных бактерий

Пробирка N	Кратность разведения	мл		Полученная суспензия содержит в 0,03 мл (эквивалентно)	Назначение
		Объем переносимой суспензии из предыдущей пробирки в последующую	Объем внесенного растворителя
1	: 3	1	2	100 млн
2	: 10	0,5	4,5	10 млн
3	: 10	0,5	4,5	1 млн
4	: 10	2	18	100000	Разливают в 3 пробирки для заражения - рабочая суспензия
5	: 10	0,5	4,5	10000	Для определения штамма
6	: 5	1,0	4,0	2000
7	: 5	1,0	4,0	400
8	: 5	1,0	4,0	80

Из пробирки 8, сразу после приготовления разведения, делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью (без конденсата) с целью подсчета количества содержащихся в ней колониеобразующих единиц (КОЕ). Растирают культуру стерильным шпателем и помещают в термостат с температурой °С на 3-4 суток. Для определения КОЕ в 30 мкл проводят подсчёт выросших колоний на 3-х чашках, полученное число делят на 10. В 30 мкл разведения из пробирки N 8 должно быть не менее 10 и не более 50 КОЕ;

Культуру в биксе (пробирки NN 4, 5, 6, 7, 8) переносят в виварий. При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента смыва культуры.

Заражение иммунизированных животных

Вакцинированным испытуемой вакциной и референс-препаратом мышам через 14-17 сут после иммунизации интрацеребрально вводят по 30 мкл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма B. рertussis 18323 (пробирка N 4) через лобную кость черепа в место, расположенное в 2 мм от средней линии и 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу N 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины разведения заражающей дозы (пробирки NN 5, 6, 7, 8) также интрацеребрально по 30 мкл вводят контрольным мышам соответствующих групп.

Через 3 сут после заражения мышей, погибших в указанный промежуток времени, исключают из опыта (неспецифическая гибель);в каждой клетке оставляют по 16 иммунизированных мышей.

За зараженными животными наблюдают 14 сут с ежедневной регистрацией их гибели в опытных и контрольных группах. В день учета результатов (14-е сутки) в число погибших включают также всех парализованных мышей.

Вычисление величины (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:

, где:

- максимальная из испытуемых доз,

- логарифм кратности испытуемых разведений,

Li - отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена,

- сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Таблица 4 - Пример расчета величины культуры тест-штамма коклюшного микроба

Доза культуры (число микробных клеток) 0,03 мл	Число зараженных животных	Число погибших (парализованных) из общего числа зараженных животных	Значения Li		Кол-во колоний в заражающей дозе 80 клеток
	10	9/10	0,9	648	23
2·	10	7/10	0,7
4·	10	4/10	0,4
80	10	2/10	0,2

микробных клеток.

В заражающей дозе ( микробных клеток) содержится 100000 : 648 = 154

Оценка иммуногенной активности испытуемой вакцины

Расчет количества МЕ в испытуемом препарате проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США для n=16 или статистических методов пробит-анализа. Примеры расчета МЕ по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6. В табл. 5 по вертикальной оси слева находят величину, выражающую сумму выживших мышей от всех трёх доз препарата (А), по горизонтальной оси - величину, выражающую разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыте (В). В месте пересечения прямых, проведённых от соответствующих величин А и В, находят (верхняя цифра) и её стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Это величина для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины в опыте, найденную в таблице величину нужно разделить на 100 и умножить на среднюю иммунизирующую дозу в данном опыте. Результаты опыта можно считать достоверными, если стандартное отклонение будет не ниже 64% и не выше 157%.

Приложение Таблица Вильсона-Вустера

Таблица 5.

Общее число мышей, выживших на все 3 дозы	41	10.1 48-208	14,5 66-154
	40	9,4 42-236	13,6 58-172	17,2 71-140
	39	9,4 38-260	13,4 53-187	17,0 66-153	20,3 76-133
	38	9,5 36-276	13,75 50-199	17,6 62-163	20,75 71-142	23,1 78-128
	37	10,2 35-288	14,5 48-208	18,5 59-170	21,7 67-148	24,3 74-134	25,9 80-125
	36	11,3 34-295	15, 5 47-213	19,7 57-175	23,1 65-154	25,9 71-140	28,0 76-131	29,0 81-124
	35	12,3 34-296	17,0 46-217	21,3 56-178	25,1 64-157	28,0 70-144	29,9 74-135	31,4 78-128	32,9 81-124
	34	14,0 34-294	19,0 46-218	23,5 55-181	27,25 63-160	30,4 68-147	32,9 73-137	34,6 76-131	35,7 49-126	39,9 81-124
	33	16,5 35-288	21,7 46-217	26,3 55-181	29,9 62-161	33,5 67-149	35,7 72-140	38,1 75-133	39,3 78-129	40,6 80-125
	32	19,4 36-279	25,1 47-214	29,4 55-181	33,5 62-162	36,8 67-150	39,3 71,141	41,9 74-134	43,25 77-131	44,0 79-127	47,7 81-124
	31	23,1 37-268	29,0 48-210	34,0 56-180	38,1 62,162	41,3 67-150	44,0 70-143	46,2 73-136	47,75 76-132	48,5 78-128	50,0 80-125
	30	28,0 39-258	34,0 49-205	38,7 56-178	43,3 62-162	46,2 66-151	49,25 70-143	50,9 73-136	52,5 75-134	53,5 77-130	55,1 79-126	59,7 81-123	61,7 82-121
	29	34,0 41-244	39,9 50-201	44,7 57-176	49,25 62,161	52,5 66-151	55,1 70-144	56,9 72-139	57,8 75-134	59,7 77-130	60,7 79-126	62,75 81-123	64,8 82-121
	28	41,9 43-233	47,7 50-196	52,5 57-174	56,0 62-161	58,8 66-151	61,7 70-144	63,7 72-139	64,8 75-134	65,8 77-131	66,9 79-137	69,1 81-123	71,3 82-121
	27	51,7 43-224	56,9 52-192	61,7 58-173	64,6 63-160	66,9 66-151	69,1 70-144	71,3 72-139	72,5 74-135	72,5 76-131	73,6 79-128	74,8 81-123	76,41 82-121
	26	64,8 44-217	69,1 53-188	72,5 58-171	74,8 63-160	76,1 67-150	78,6 70-144	79,8 72-139	79,8 74-134	84,4 76-131	84,4 78-128	82,4 81-123	82,4 82-121
	25	79,8 47-211	82,4 54-187	85,1 59-170	86,5 63-159	87,9 67-150	87,9 70-144	89,25 72-139	89,25 74-134	89,25 76-131	90,8 78-128	90,8 81-123	90,8 82-121
	24	100 48-211	100 54-186	100 59-170	100 63-159	100 67-150	100 70-144	100 72-139	100 74-134	100 77-131	100 79-127	100 81-123	100 83-120
	23	125,3 47-211	121,3 54-187	117,5 59-170	115,6 63-159	113,7 67-150	113,7 70-144	111,75 72-139	111,75 74-134	111,75 76-131	110,25 78-128	110,25 81-123	110,25 82-121
	22	154,4 46-217	144,8 53-188	138,0 58-172	133,6 63-160	131,5 67-150	127,3 70-144	125,3 72-139	125,3 74-134	123,3 76-131	123,3 78-128	121,3 81-123	121,3 82-121
	21	193,3 45,224	175,7 52-192	162,2 58-173	154,4 63-160	149,5 66-151	144,75 70-144	140,2 72-139	138,0 74-135	138,0 76-131	135,8 79-128	133,6 81-123	131,5 82-121
	20	238,5 43-233	209,7 50-196	190,3 57-174	178,5 62-161	170,1 66-151	162,2 70-144	157,0 72-139	154,4 75-134	152,0 77-131	149,5 79-127	144,3 81-123	140,2 82-121
	19	294,0 41-244	250,3 50-201	223,6 57-176	203,0 62-161	190,3 66-151	181,4 70-144	175,7 72-139	172,9 75-134	167,4 77-130	164,7 79-126	159,5 81-123	154,4 82,121
	18	356,6 39-258	294,0 49-205	258,5 56-178	231,0 62-162	216,5 66-151	203,0 70-143	196,5 73-137	190,3 75-134	187,3 77-130	181,4 79-126	167,4 81-123	162,2 82-121
	17	432,6 38-268	345,3 48-210	294,0 56-180	262,7 62-162	242,4 67-150	227,5 70-143	216,5 73-136	209,7 76-132	206,3 78-128	199,8 80-125
	16	516,5 36-279	399,1 47-214	339,8 55-181	298,7 62-162	271,2 67-150	254,6 71-141	238,5 74-134	231,0 77-131	227,5 79-127	209,7 81-124
	15	606,5 35-288	461,1 46-217	380,3 55-181	334,5 62-162	298,7 67-149	280,4 72-140	262,0 75-133	254,6 78-130	246,3 80-125
	14	712,3 34-294	524,8 46-218	425,7 55-181	368,2 63-160	329,1 68-147	303,6 73-137	289,3 76-131	280,1 79-126	250,3 81-124
	13	810,4 34-296	587,4 46-217	468,8 56-178	399,25 64-157	356,6 70-144	334,5 74-135	318,75 78-128	303,6 81-124
	12	908 34-295	647,6 47-213	508,6 57-175	432,6 65-154	386,5 71-140	356,6 76-131	345,3 81-124
	11	983 35-285	690,6 48-208	542 59-170	464,4 67-148	413,3 74-134	386,5 80-125
	10	1048 36-276	727,3 50-199	568,75 62-163	484,2 71-142	432,6 78-128
	9	1065 38-260	747,9 53-187	567,4 66-153	492 76-133
	8	1065 42-236	736,6 58-172	578 71-140
	7	999,25 48-208	691,25 68-153
	6	678,5 57-176
		5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
		Разница выживших от наибольшей и от наименьшей дозы

Таблица 6 - Пример расчёта активности вакцины

Препарат	Доза препарата в 0,5 мл			Количество выживших мышей/общее число зара-женных на дозу	Величины А /В и * по таблице	стадартные от-клонения в опыте
	Разведение	Количество исходного препарата в мл	Количе-ство МЕ в иммунизирующей дозе
референс-препарат	1:60	0,0167	0,5	14/16	27/11 71,3 72-139	0,0023 (0,00327- 0,00169)
	1:300	0,0033	0,1	10/16
	1:1500	0,00066	0,02	3/16
вакцина	1:28	0,0357		13/16	23/11 111,75 72-139	0,0079 (0,011- -0,0057)
	1:140	0,0071		8/16
	1:700	0,00142		2/16

Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 МЕ (табл. 6). При определении референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в МЕ.

МЕ

МЕ

МЕ

 мл

 мл

 мл

Количество МЕ в 1 мл вакцины определяют по формуле:

МЕ/мл

Доверительный интервал значения иммуногенности (МЕ в 1 мл) препарата рассчитывают по формуле: R : / x К , где

R - количество МЕ в 1 мл препарата; К - доверительный коэффициент.

, где

для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия - 95% или 99%;

для менее иммуногенного препарата.

Для нашего примера:

.

К = 1,6 Отсюда:

; т.е. 9,0 МЕ : 1,6 = 5,6 МЕ

; т.е. 9,0 МЕ x 1,6 = 14,4 МЕ

Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 МЕ с доверительным интервалом от 5,6 МЕ до 14,4 МЕ.

Если в первом опыте активность препарата не соответствует нормативным требованиям, опыт повторяют. В этом случае, при вычислении количества МЕ в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3-х). Используют расчет средней геометрической (X геом) величины значения по формуле:

,

где:

- произведение усредняемых величин

n - число определений

Критерии достоверности теста:

- 1 не должна превышать 1000 микробных клеток;

- заражающая доза микробных клеток должна содержать не менее 100 и не более 1000 ;

- в 30 мкл разведения из пробирки N 8 должно быть не менее 10 и не более 50 КОЕ;

- референс-препарата и испытуемой вакцины лежит в интервале между наибольшей и наименьшей иммунизирующими дозами.

Для подтверждения стандартности теста необходимо с помощью карт Шухарта проводить мониторинг значений референс вакцины и заражающего штамма [1].

Активность вакцины отвечает требованиям, если результаты теста свидетельствуют, что установленная активность разовой дозы вакцины (0,5 мл) не ниже 4,0 МЕ и нижний предел значения доверительного интервала (р = 0,95) установленной активности не менее 2,0 МЕ/0,5 мл.