Методические указания. МУК 4.1. 3055-13 "Определение остаточных количеств крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 июля 2013 г.)

Методические указания.
МУК 4.1. 3055-13
"Определение остаточных количеств крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 июля 2013 г.)

Введены впервые

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.121/01.0004343/2013 от 18.01.2013

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций 0.01 - . Методические указания носят рекомендательный характер.

Крезоксим-метил

(Е)-метил-2-метоксиимино-2-{2-(о-толилокси-метил)фенил}ацетат (IUPAC).

Мол. масса: 313.4

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество со слабым запахом.

Температура плавления: 97.2 - 101.7°С.

Давление пара при 20°С: .

Растворимость (в при 20°С): вода - 0.002, гептан - 1.7, толуол - 111, дихлорметан - 939, метанол - 14.9, ацетон - 217, этилацетат - 123.

Стабильность к гидролизу при 20°С: дня (рН 7), 7 часов (рН 9). В биологически активных почвах в аэробных условиях крезоксим-метил быстро разрушается: - менее 3 дней.

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность для крыс более 5000 мг/кг, острая дермальная токсичность для крыс превышает 2000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами. Не токсичен для пчел, дождевых червей, полезных насекомых и птиц.

Область применения препарата: синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.

В России для крезоксим-метила гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0.95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости) , %	Показатель внутрилабораторной прецизионности, , %	Показатель воспроизводимости, ,%	Показатель точности* (границы относительной погрешности), , %
Зеленая масса	0.01 - 0.1	6	8	10	20
Солома	0.01 - 0.1	6	8	10	20
Зерно	0.01 - 0.1	7	8	11	23
Ботва	0.01 - 0.1	7	8	11	23
Корнеплоды	0.01 - 0.1	7	9	12	25

______________________________

* соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k=2.

Таблица 2

Полнота извлечения крезоксим-метила, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n=20, Р=0.95

Анализируемый объект, мг/кг	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения %	Стандартное отклонение, S,%	Доверительный интервал среднего результата,
Зеленая масса	0.01	0.01 - 0.1	89.5	2.65	1.32
Солома	0.01	0.01 - 0.1	89.8	2.36	1.18
Зерно	0.01	0.01 - 0.1	91.0	3.37	1.68
Ботва	0.01	0.01 - 0.1	92.2	3.31	1.65
Корнеплоды	0.01	0.01 - 0.1	88.7	7.46	3.73

2. Метод измерений

Методика основана на определении крезоксим-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом, очистки экстракта промывкой гексаном и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация крезоксим-метила проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0.2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0.1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные на 10, 100 и , ГОСТ 23932-90.

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до и от 1 до , ГОСТ 50444.

Цилиндры мерные на 50 и , ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501-2005.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Кислота ортофосфорная (), химически чистая, ГОСТ 6552-80.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0.005 М в соотношении 50:50.

Смесь н-гексан - этилацетат в соотношении 9:1 по объему.

Крезоксим-метил, аналитический стандарт, 98.3%.

Этилацетат, химически чистый, ГОСТ 1138-84.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка с функциональными группами С18, связанными этиленгибридными мостиками (100 x 2.1) мм, 1.7 мкм.

Аппарат для встряхивания проб, ТУ 64-1-1081-73

Воронки делительные, вместимостью , ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25 и ГОСТ 9737-93.

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0.4 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Пробирки полипропиленые центрифужные с крышками объемом .

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об/мин.

Примечание: Допускается применение оборудования аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда- по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха и относительной влажности не более 80%. выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы () до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0.005 М раствор ортофосфорной кислоты: 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом , растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0.005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1, встряхивают в течение 2 мин, после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией : точную навеску крезоксим-метила помещают в мерную колбу вместимостью , растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями крезоксим-метила 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью вносят основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения крезоксим-метила в зеленой массе, соломе и зерне зерновых колосовых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация крезоксим-метила в растворе) в хроматограф вводят по градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С=KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0.99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

, где

С - аттестованное значение массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

- результат контрольного измерения массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при Р=0.95).

7.5. Подготовка патронов для очистки экстрактов

Два последовательно соединенных патрона для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля промывают последовательно смесью гексан - этилацетат (9:1, по объему) и гексана, после чего они готовы к работе.

7.6. Проверка хроматографического поведения крезоксим-метила на патронах

В круглодонную колбу емкостью отбирают стандартного раствора крезоксим-метила с концентрацией . Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в гексана и переносят на подготовленные патроны. Колбу обмывают гексана и смыв тоже вносят на патроны. Промывают патроны гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют крезоксим-метил смесью гексан:этилацетат (9:1 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек. Отбирают фракции по , упаривают досуха, растворяют в подвижной фазы (ацетонитрил:0.005М , 50:50) и анализируют по п. 9.3. Фракции, содержащие крезоксим-метил объединяют.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна"; Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Отбор проб свеклы производится в соответствии с ГОСТ 1722-85 "Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая". Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18°С и хранят в герметично закрытой полиэтиленовой таре.

9. Проведение определения

9.1. Определение крезоксим-метила в зеленой массе, соломе и зерне зерновых колосовых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы

Навеску измельченной пробы (10 г - зерно, корнеплоды; 5 г - зеленая масса, солома, ботва) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью и добавляют ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4000 об/мин в течение 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу. К остатку добавляют 30 мл ацетонитрила и проводят повторную экстракцию. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Остаток переносят в делительную воронку тремя порциями ацетонитрила, насыщенного гексаном, и дважды промывают гексаном по . Ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.2 Очистка на двух последовательных патронах для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1.), количественно переносят двумя порциями гексана на подготовленные патроны (п. 7.5.). Промывают патроны гексана. Крезоксим-метил элюируют смеси гексан - этилацетат (9:1, по объему). Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50) и анализируют на содержание крезоксим-метила по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (100 x 2.1) мм, 1.7 мкм, заполненная сорбентом с функциональными группами С18, связанными этиленгибридными мостиками.

Температура колонки . Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента . Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 230 нм. Объем вводимой пробы .

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание крезоксим-метила в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- - площадь пика крезоксим-метила на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

- К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

- V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

- Р - навеска анализируемого образца, г;

- f - полнота извлечения крезоксим-метила, приведенная в табл.2, (%).

Содержание остаточных количеств крезоксим-метила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор крезоксим-метила с концентрацией , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

(1)

- результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости ().

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р=0.95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0.01 мг/кг*, где *-0.01 мг/кг - предел обнаружения крезоксим-метила в зерне).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутри-лабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

,

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

,

где X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

(1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

,

где - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Руководитель Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко