Методические указания. МУК 4.1. 3054-13 "Определение остаточных количеств карбоксина в зерне кукурузы, сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 июля 2013 г.)

Методические указания.
МУК 4.1. 3054-13
"Определение остаточных количеств карбоксина в зерне кукурузы, сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека 5 июля 2013  г.)

Введены впервые

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.128/01.00043/2013

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации карбоксина в зерне кукурузы, зерне сои и растительном масле в диапазоне концентраций 0.01 - 0.1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Карбоксин

5,6-дигидро-2-метил-1,4-оксатиин-3-карбоксанилид (IUPAC)

5,6-дигидро-2-метил-N-фенил-1,4-оксатиин-3-карбоксамид (С.А.)

, мол. масса 235,3

Белый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 91.5 - 92.5°С и 98 - 100°С (в зависимости от типа кристаллов).

Давление паров при 25°С: .

Коэффициент распределения н-октанол-вода: (20°С).

Растворимость (в при 20°С): вода - 0.134, метанол - 89, ацетон - 220, этилацетат - 111, дихлорметан - 353.

Вещество устойчиво к гидролизу (25°С, рН 5 - 9), быстро разлагается в водных растворах при выдерживании на свету (рН 9, ).

Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность для крыс - 2588 мг/кг, острая дермальная токсичность для кроликов > 4000 мг/кг.

Мутагенный эффект при использовании препарата не наблюдался. Класс токсичности по ВОЗ - III.

Область применения препарата: Карбоксин - фунгицид системного действия, используется для обработки семян зерновых культур против головневых болезней, корневых гнилей и плесневения семян. Не применяется совместно с пестицидами, имеющими в молекуле длинные углеводородные цепи или обладающими кислой реакцией.

Гигиенические нормативы для карбоксина в России: ПДК в воде водоемов ; ОДК в почве 0.05 мг/кг; МДУ: кукуруза (зерно), просо, зерно хлебных злаков, картофель - 0.2 мг/кг, кукуруза (масло) - нт.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0.95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости) , %	Показатель внутрилабораторной прецизионности, , %	Показатель воспроизводимости, ,%	Показатель точности* (границы относительной погрешности), , %
Зерно кукурузы	0.01-0.1	6	8	11	22
Зерно сои	0.01-0.1	6	8	11	22
Масло	0.01-0.1	6	7	10	20

______________________________

* соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k=2

Таблица 2

Полнота извлечения карбоксина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n=20, Р=0.95

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Полнота извлечения, %	Стандартное отклонение, S,%	Доверительный интервал среднего результата,
Зерно кукурузы	0.01	0.01-0.1	87.9	0.96	0.48
Зерно сои	0.01	0.01-0.1	83.6	5.20	2.60
Масло	0.01	0.01-0.1	83.2	1.11	0.55

2. Метод измерений

Методика основана на определении карбоксина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом, очистки экстракта промывкой гексаном и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация карбоксина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженном дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0.2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0.1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные на 10, 100 и , ГОСТ 23932-90.

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до и от 1 до .

Цилиндры мерные на 50 и , ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Карбоксин, аналитический стандарт, 99.2%.

Ацетон, особой чистоты, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501-2005.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Кислота ортофосфорная (), химически чистая, ГОСТ 6552-80.

Метилен хлористый, химически чистый, ТУ 2631-019-44493179-98.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0.005 М Н3РO4 в соотношении 30:70.

Смесь N 1: хлористый метилен - ацетон в соотношении 9:1 по объему.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100x2.1) мм, 1.7 мкм.

Аппарат для встряхивания проб, ТУ 64-1-1081-73

Воронки делительные, вместимостью , ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10 и , ГОСТ 9737-93.

Колбы плоскодонные конические вместимостью , ГОСТ 25336-82.

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0.4 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом .

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об/мин.

Примечание: Допускается применение оборудования аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0.005 М раствор ортофосфорной кислоты: 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом , растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0.005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1, встряхивают в течение 2 мин, после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией : точную навеску карбоксина помещают в мерную колбу вместимостью , растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями карбоксина 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью вносят основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают 2 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают 1 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4°С в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения карбоксина в зерне кукурузы, семенах сои и растительном масле используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбоксина в растворе) в хроматограф вводят по градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбоксина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С=KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0.99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

, где

С - аттестованное значение массовой концентрации карбоксина в градуировочном растворе,

- результат контрольного измерения массовой концентрации карбоксина в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( при Р=0.95).

7.5. Подготовка патрона для очистки экстрактов

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, промывают последовательно смеси N 1 и гексана, после чего патрон готов к работе.

7.6. Проверка хроматографического поведения карбоксина на патроне

В круглодонную колбу емкостью отбирают стандартного раствора карбоксина с концентрацией . Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в гексана и переносят на подготовленный патрон. Колбу обмывают гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон гексана и хлористого метилена, элюаты отбрасывают. Затем элюируют карбоксин смесью N 1 со скоростью 1-2 капли в сек. Отбирают фракции по , упаривают досуха, растворяют в подвижной фазы (ацетонитрил - 0.005М , 30:70) и анализируют по п. 9.4. Фракции, содержащие карбоксин, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Внимание! Температура бани не должна превышать 30°С, экстракты следует упаривать осторожно, т.к. вещество достаточно высоколетучее.

Примечание: Проверку хроматографического поведения карбоксина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также отбор проб зерна кукурузы производится по ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовке и поставках", зерна сои - по ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Пробы зерна для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре.

Для длительного хранения зерно подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы растительного масла хранят в холодильнике при 0-4°С в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция карбоксина

9.1.1. Экстракция карбоксина из зерна кукурузы и сои

Навеску измельченного зерна (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью и добавляют ацетонитрила, насыщенного гексаном. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин и центрифугируют при скорости 4000 об/мин в течение 10 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют, фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку. К остатку в пробирке добавляют ацетонитрила, насыщенного гексаном и проводят повторную экстракцию. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

9.1.2. Экстракция карбоксина из растительного масла

Навеску масла (5 г) растворяют в гексана, помещают в делительную воронку, добавляют ацетонитрила, насыщенного гексаном, и интенсивно встряхивают в течение 2-3 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отбирают, к гексановому слою добавляют насыщенного ацетонитрила и экстракцию повторяют. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

9.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К ацетонитрильному экстракту, полученному по п. 9.1 и помещенному в делительную воронку на , добавляют гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения слоев, верхний гексановый слой отбрасывают.

Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и повторяют операцию очистки с новой порцией гексана объемом .

Затем ацетонитрильный экстракт переносят в колбу для упаривания на и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе.

Внимание! Температура бани не должна превышать 30°С, экстракты следует упаривать осторожно, т.к. вещество достаточно высоколетучее.

Дальнейшую очистку сухого остатка проводят на патронах для твердофазной экстракции по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на патронах для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов п. 9.2, растворяют в гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу обмывают гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон гексана, хлористого метилена, элюаты отбрасывают. Карбоксин элюируют смеси N 1. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу вместимостью и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30°С. Внимание! Температура бани не должна превышать 30°С, экстракты следует упаривать осторожно, т.к. вещество летучее.

Сухой остаток растворяют в подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70) и анализируют на содержание карбоксина по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (2.1x100) мм, 1.7 мкм, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18. Температура колонки . Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70. Скорость потока элюента . Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 250 нм. Объем вводимой пробы .

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбоксина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- - площадь пика карбоксина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

- К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

- V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

- Р - навеска анализируемого образца, г;

- f - полнота извлечения карбоксина, приведенная в табл. 2, (%).

Содержание остаточных количеств карбоксина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбоксина с концентрацией , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придела повторяемости (1):

(1)

- результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости ().

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р=0.95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0.01 мг/кг*, где * - 0.01 мг/кг - предел обнаружения карбоксина в зерне).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутри-лабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

,

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

,

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

,

где X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

. (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

,

где - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко