Методические указания МУК 4.1.3051-13 "Определение остаточных количеств флуксапироксада в зеленой массе и клубнях картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 июля 2013 г.)

Методические указания МУК 4.1.3051-13
"Определение остаточных количеств флуксапироксада в зеленой массе и клубнях картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 июля 2013 г.)

Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.127/01.00043/2013

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флуксапироксада в клубнях картофеля, яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках в диапазоне концентраций 0.005 - 0.05 мг/кг, в зеленой массе - в диапазоне концентраций 0.01 - 0.1 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.

Флуксапироксад

3-(дифторметил)-1-метил-N(3`,4`,5`-трифтор[1,1'-бифенил]-2-ил)-1Н-п иразол-4- карбоксамид (IUPAC).

Мол. масса 381

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха.

Температура плавления: > 157°С.

Давление пара  мРа.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода lgP>3.0 (20°С).

Растворимость в воде (, 20 °С): 3.88.

Растворимость в органических растворителях (, 20°С): ацетон > 250; ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат > 100, метанол - 53.4, толуол - 20.0.

Гидролитически стабилен в водных растворах при рН 4-9.

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная -  мг/кг массы тела. Острая кожная -  мг/кг массы тела.

Острая ингаляционная - (4 ч.)> 5,1 мг/л

Раздражающее действие - Кролики: кожа - не раздражает; глаза - не раздражает.

Сенсибилизация - не обладает.

Область применения: фунгицид для обработки вегетирующих растений против комплекса болезней зерновых культур.

В России для флуксапироксада гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0.95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости) , %	Показатель внутрилабораторной прецизионности, , %	Показатель воспроизводи мости, , %	Показатель точности* (границы относительной погрешности), , %
Зеленая масса	0.01-0.1	6	7	10	20
Клубни картофеля	0.005-0.05	7	9	12	23
Яблоки	0.005-0.05	7	9	12	23
Яблочный сок	0.005-0.05	6	7	10	20
Виноград	0.005-0.05	7	9	12 .	23
Виноградный сок	0.005-0.05	6	7	10	20

Таблица 2

Полнота извлечения флуксапироксада, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0.95

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Полнота извлечения, %	Стандартное отклонение, S	Доверительный интервал среднего результата, , %
Зеленая масса	0.01	0.01 - 0.1	91.0	0.89	0.45
Клубни картофеля	0.005	0.005 - 0.05	86.1	2.71	1.36
Яблоки	0.005	0.005 - 0.05	90.9	2.95	1.48
Яблочный сок	0.005	0.005 - 0.05	95.5	3.55	1.78
Виноград	0.005	0.005 - 0.05	96.2	2.97	1.49
Виноградный сок	0.005	0.005 - 0.05	94.4	3.32	1.66

2. Метод измерений

Методика основана на определении флуксапироксада методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью, очистки перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и последующей очистки на патроне с гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля.

Идентификация флуксапироксада проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0.2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0.1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные на 10, 100 и 1000 , ГОСТ 23932-90.

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1000  и от 1 до
5 .

Цилиндры мерные на 50 и 100 , ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Ацетон, особой чистоты, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная. деионизованная), ГОСТ Р 52501-2005.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Кислота ортофосфорная , химически чистая, ГОСТ 6552-80.

Метилен хлористый, химически чистый, ТУ 2631-019-44493179-98.

Натрия гидроксид, химически чистый, ГОСТ 4328-77.

Натрий сернокислый безводный, химически чистый, ГОСТ 4166-76.

Натрия хлористый, чистый для анализа, ГОСТ 4233-77.

Смесь N 1: этилацетат - гексан в соотношении 1:4 по объему.

Смесь N 2: этилацетат - гексан в соотношении 1:1 по объему.

Смесь N 3: ацетон - вода в соотношении 3:1 по объему.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0.005 М в соотношении 40:60.

Флуксапироксад с содержанием основного вещества 99.7%.

Этилацетат, химически чистый, ГОСТ 1138-84.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100x2.1) мм, 1.7 мкм.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные, вместимостью 250 , ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 ГОСТ 9737-93.

Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 ГОСТ 25336-82

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0.4 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Стаканы химические вместимостью 150 ГОСТ 25336-82.

Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 35 кГц.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха °С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0.1-0.2 ) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон с гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля промывают 2  смеси N 2, затем 3  гексана.

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0.005 М раствор ортофосфорной кислоты:  г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 , растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0.005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.3.3. 20% раствор хлорида натрия: мерную колбу объемом 1  помещают 200 г хлорида натрия, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.4. 0.0025 М раствор гидроксида натрия: 1.0 г гидроксида натрия помещают в мерную колбу объемом 1 , растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов:

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0.5 : точную навеску флуксапироксада ( мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 , растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями флуксапироксада 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 и 1.0  готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60).

7.4.2.1. Раствор N 1 с концентрацией 1.0 : в мерную колбу вместимостью 100  вносят 0.2  основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор N 2 с концентрацией 0.5 : в мерную колбу вместимостью 10  помещают 5.0   раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор N 3 с концентрацией 0.2 : в мерную колбу вместимостью 10  помещают 2  раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор N 4 с концентрацией 0.1 : в мерную колбу вместимостью 10  помещают 1  раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор N 5 с концентрацией 0.05 : в мерную колбу вместимостью 10  помещают 0.5  раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения флуксапироксада в клубнях и зеленой массе картофеля, яблоках, яблочном соке, винограде и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация флуксапироксада в растворе) в хроматограф вводят по 10  градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С=KS,

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0.99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

,

где С - аттестованное значение массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе,

- - результат контрольного измерения массовой концентрации флуксапироксада в градуировочном растворе,

- - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. при Р=0.95).

7.6. Проверка хроматографического поведения флуксапироксада на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10  отбирают 1  стандартного раствора флуксапироксада с концентрацией 1 . Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1  гексана и переносят на подготовленный патрон. Колбу обмывают 1  гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 6  смеси N 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флуксапироксад смесью N 2 со скоростью 1-2 капли в сек. Отбирают фракции по 2 , упаривают досуха, растворяют в 1  подвижной фазы (ацетонитрил - 0.005М , 40:60) и анализируют по п. 9.4. Фракции, содержащие флуксапироксад, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание: Проверку хроматографического поведения флуксапироксада следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также Отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия". Пробы ягод винограда хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше - 18°С в течение 6 месяцев. Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки". Пробы виноградного и яблочного сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18°С в течение месяца, в холодильнике при температуре 0 - 4°С в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

Отбор проб картофеля производится в соответствии с ГОСТ 26832-86 "Картофель свежий для переработки на продукты питания". Пробы клубней и ботвы картофеля для определения остатков в урожае хранят в морозильной камере при -18°С.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция флуксапироксада из зеленой массы и клубней картофеля, яблок и винограда

Навеску измельченной культуры (10 г - зеленая масса, 20 г - клубни картофеля, яблоки, виноград) помещают в коническую колбу вместимостью 100 , добавляют 40  смеси N 3 и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Водно-ацетоновый экстракт декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 , пропуская через бумажный фильтр к остатку в колбе добавляют 30  смеси N 3 и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка, доводят объем до 100  20%-ым водным раствором хлорида натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 250 , добавляют 30  хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2-3 мин. После полного разделения фаз, нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30  хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции дважды промывают в делительной воронке 20  0.0025 М раствора гидроксида натрия, пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100  и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

9.2. Экстракция флуксапироксада из яблочного и виноградного соков

Навеску 10 г сока помещают в стакан вместимостью 150 , доводят объем до 100  20%-ым водным раствором хлорида натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 250 , добавляют 30  хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2-3 мин. После полного разделения фаз, нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30  хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке два раза по
20  0.0025 М раствора гидроксида натрия, пропускают через воронку, содержащую безводный сульфат натрия, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100  и растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

9.3. Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Сухой остаток, полученный по пп. 9.1 или 9.2, растворяют в 1  гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон, колбу ополаскивают 1  гексана и так же наносят на патрон. Патрон промывают 6  смеси N 1, элюат отбрасывают. Флуксапироксад элюируют 5  смеси N 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 1  подвижной фазы и 10 вводят в хроматограф.

9.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (2.1x100) мм, 1.7 мкм, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18. Температура колонки °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0.005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60. Скорость потока элюента: 0.2 . Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 .

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флуксапироксада в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

,

где - площадь пика флуксапироксада на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения флуксапироксада, приведенная в табл. 2, (%).

Содержание остаточных количеств флуксапироксада в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флуксапироксада с концентрацией 1.0 , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р=0.95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0.005 мг/кг*, где *-0.005 мг/кг - предел обнаружения флуксапироксада в клубнях картофеля).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутри-лабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

,

где - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг. Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

(1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, (3)

где - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко