Методические рекомендации "Оценка токсичности товаров бытовой химии. Экспресс-метод оценки токсичности моющих средств с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27 декабря 2001 г. N 29ФЦ/4746)

Методические рекомендации
"Оценка токсичности товаров бытовой химии. Экспресс-метод оценки токсичности моющих средств с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27 декабря 2001 г. N 29ФЦ/4746)

1. Область применения

Методические рекомендации содержат описание метода оценки токсичности моющих средств с применением кратковременной суспензионной культуры подвижных клеток (сперматозоидов быка) и определяют порядок проведения испытаний следующих видов товаров бытовой химии (ТБХ): синтетические моющие средства и средства, используемые для обработки посуды и другого инвентаря и оборудования, имеющего контакт с пищевыми продуктами.

Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки токсичности серийно выпускаемых моющих средств.

Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

Методические рекомендации предназначены для учреждений и организаций, занимающихся токсикологической оценкой ТБХ и осуществлением санитарного надзора за их производством и применением.

2. Сущность метода

Сущность методики состоит в исследовании острой токсичности вытяжки из испытываемых ТБХ с применением клеточного тест-объекта. В качестве тест-объекта используется сперма крупного рогатого скота, замороженная в парах жидкого азота. Гранулы замороженной бычьей спермы получают на станциях искусственного осеменения и хранят в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом. В основе метода лежит исследование изменения зависимости двигательной активности сперматозоидов от времени под воздействием химических соединений, содержащихся в вытяжке из исследуемых образцов. Показатель подвижности, m = f (t) определена как:

, где

m - показатель подвижности клеток;

d - постоянный коэффициент;

- концентрация подвижных клеток;

V - средний модуль скорости клеток.

Оценка показателя подвижности осуществляется путем подсчета подвижных сперматозоидов автоматически через определенные промежутки времени. Вычисляется суммарная двигательная активность S в каждом капилляре.

3. Оборудование, химическая посуда и реактивы

3.1. Стенд для испытаний моющих средств на токсичность - анализатор токсичности, комплект кювет.

3.2. Химическое оборудование:

- пробирки с притертыми пробками, объемом 3-5 мл - 10 шт.;

- дозаторы пипеточные, на объемы 0,5, 0,2 и 0,1 мл;

- мерные колбы с притертыми пробками, объемом 250 мл - 2 шт.

3.3. Весы аналитические, с погрешностью взвешивания не более 1 мг.

3.4. Пинцет анатомический, длиной 250 мм.

3.5. Сосуд Дьюара типа СДС, объемом не менее 25 л и диаметром горла не менее 50 мм - 2 шт.

3.6. Глюкоза ч., ГОСТ 6038.

3.7. Цитрат натрия трехзамещенный ч., ГОСТ 22280.

3.8. Сперма быка, замороженная в жидком азоте, ГОСТ 26030.

3.9. Фильтры бумажные обеззоленные "красная", "синяя лента", ТУ 6-09-1678-86.

4. Приготовление рабочих растворов

4.1. Испытуемый образец в количестве 0,1 г помещается в мерную колбу, объемом 250 мл, и доводится до метки дистиллированной водой, что соответствует разведению испытуемого образца 1:2500. Это разведение является стандартным для исследования моющих средств. Колба закрывается притертой пробкой. В другую колбу в качестве контроля помещается 250 мл дистилированной воды и закрывается притертой пробкой. Обе колбы (контроль и опыт) ставят в термостат на сутки при температуре 37°С, затем охлаждают на лабораторном столе до комнатной температуры.

4.2. Фильтрование. После охлаждения опытный раствор подвергают фильтрованию через бумажный фильтр с целью удаления взвешенных частиц. Фильтрованию подвергают также и контрольную воду.

4.3. Подготовка фильтров. В качестве фильтра используются бумажные фильтры ("красная" или "синяя лента"), диаметром 90 мм. Бумажные фильтры должны быть заранее промыты и просушены. Для этого предварительно до начала эксперимента 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1 л дистилированной воды. Стакан накрывают стеклянной пластинкой и ставят в термостат на 24 ч при температуре 37°С. Затем дистиллированную воду выливают, а стакан с мокрыми фильтрами ставят обратно в термостат с целью высушивания фильтров до постоянной массы. Достижение постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.

4.4. Приготовление изотонических растворов. Полученные фильтраты (опыт и контроль) доводят до изотонии, добавляя в них сухие реактивы цитрата натрия и глюкозы. На 10 мл фильтрата добавляется 0,1 г цитрата натрия и 0,4 г глюкозы.

5. Проведение испытаний

5.1. Определение суммарной двигательной активности S сперматозоидов проводится в изотонических фильтратах рабочих растворов при постоянной температуре 40°С. Поддержание температуры осуществляется автоматическим устройством термостатирования.

5.2. Контрольный и опытный изотонические растворы готовят не менее чем за час до начала эксперимента, а затем по 0,4 мл разливают в пробирки с притертыми пробками и ставят в термостат при температуре 40°С.

5.3. Оттаивают замороженную сперму в разбавителе. Состав разбавителя: глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 мл. В чистую сухую пробирку наливают разбавитель, согласно паспорту на сперму быка, и ставят в термостат при температуре 40°С. Анатомическим пинцетом, охлажденным до температуры жидкого азота, извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и опускают в нагретый разбавитель.

Примечание. Подготовка разбавителя. При использовании непаспортизованной партии гранул замороженной спермы нужно предварительно за несколько дней до испытаний выбрать оптимальный объем разбавителя для приготовления раствора спермы. Для этого в пробирки разлить разный объем разбавителя  мл. Поместить в термостат при температуре 40°С, дать нагреться и в каждую пробирку поместить по одной грануле замороженной спермы. Сразу после размораживания гранул из каждой пробирки берут по 0,1 мл маточного раствора спермы и переносят в пробирки с изотоническим раствором, объем изотонического раствора в каждой пробирке - 0,4 мл. Заполняют капилляры. Проводят эксперимент. Получают зависимость: концентрация сперматозоидов - время подвижности и выбирают оптимальный объем разбавителя, при котором время подвижности сперматозоидов составляет  ч.

5.4. В каждую пробирку и с контрольной средой и с опытным раствором (экстрактом) моющих средств приливают по 0,1 мл раствора спермы и тщательно перемешивают. Каждый раствор переносят в капилляры (4-5 на один образец) и устанавливают в каретку прибора. Проводят измерения согласно инструкции.

5.5. Математическая обработка результатов измерений. Вычисляется суммарная двигательная активность S в каждом капилляре:

, где

m - i-тое значение показателя подвижности в j-том капилляре;

j - порядковый номер капилляра.

Для контрольной и опытной выборок капилляров вычисляют среднее арифметическое значение показателя подвижности и его среднеквадратическое отклонение, затем для каждой выборки вычисляют коэффициент вариации С:

%, где

- среднее отклонение;

Х- среднее арифметическое значение.

В случае получения значения коэффициента вариации более 25% хотя бы для одной из выборок, эксперимент повторяют, начиная с п. 5.1. Если значения коэффициента вариации для каждой из выборок меньше или равно 25%, то результаты считаются пригодными для статистической обработки. Вычисляют величину индекса токсичности:

%, где

и - средние арифметические значения величины суммарной двигательной активности сперматозоидов опытной и контрольной выборок.

6. Оценка результатов испытаний

Оценка результатов испытаний осуществляется путем сравнения полученного значения индекса токсичности для исследованного образца и допустимого интервала индекса токсичности. Индекс токсичности в интервале от 70-120% свидетельствует о том, что моющее средство не оказывает общетоксического и/или кожно-раздражающего действия при соблюдении условий применения согласно инструкции.

Во всех остальных случаях результаты указывают на несоответствие гигиеническим требованиям к моющим средствам.

Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

Е.Н. Беляев